AQUAPORINAS – A HOMOLOGIA DE SUB-FAMÍLIAS PROTEICAS.

Descrever a função biológica de uma proteína, ou sua estrutura molecular não explica sua origem. O fato de certas moléculas terem uma atuação fundamental para a célula, ou ter uma estrutura formada por várias subunidades não significa simplesmente nada do ponto de vista teleológico.

aquaporina 2

Representação esquemática do movimento da água através do filtro de seletividade do canal estreito da proteína Aquaporina.

Infelizmente, as pessoas acham que algo complexo, estético ou bonito é resultado de criação proposital. Por essa razão arrancaram de Paley uma ideia que hoje dá a entender que proteínas são especialmente projetas para suas respectivas funções, que suas funções são complexamente especificadas e irredutíveis, ou que o funcionamento de maquinários moléculas são perfeitos. Sabemos que não são, pois exemplos vindos do flagelo bacteriano, do sistema imunológico, de enzimas mitocondriais e mesmo de aquaporinas expõem a falha perfeccionista do projetista.

Um bom exemplo disso, e que tem sido exposto no Brasil como um mecanismo complexo e, portanto, irredutível que exemplifica um projetista são as proteínas aquaporinas.

Descrever sua função celular não a torna especial, nem a torna exemplo de criação proposital. Isso ocorre por diversos motivos: primeiro porque sua má atuação não compromete a sobrevivência do seu portador; segundo, ela faz parte de uma família de proteínas que tem diversos homólogos evolutivos, especialmente em eucariotos.

Os proponentes do movimento fundamentalista do Design inteligente (D.I) geralmente acusam que tal proteína é resultado de projeto inteligente. Entretanto, para afirmar que alguma proteína foi criada intencionalmente ela não deveria conter homólogo evolutivos entre grupos biológicos.

Toda proteína é resultado da expressão de um gene. Genes são fragmentos de DNA, onde estão armazenadas as informações genéticas para construção de diversas proteínas. Uma proteína é uma molécula. Olha a estrutura da molécula e inferir criação proposital é uma abordagem muito superficial, pois não leva em consideração a informação que a criou, ou seja, não demonstra essencialmente de onde ela veio.

Ao analisar uma biomolécula não basta ver somente sua estrutura molecular, é preciso ver sua origem, a partir do DNA; onde esta a informação de sua construção. É na sequencia de letras (A-T/C-G) do gene que esta a informação para a construção da proteína como a aquaporina. Entretanto, nessa sequencia esta também outra informação que buscamos; se essa sequencia é homóloga com outros grupos biológicos. Se grupos biológicos mais próximos têm genes semelhantes, padrões de ativação de genes próximos e redes de genes próximas, temos uma homologia consistente consolidada. A tendência é que quanto mais filogeneticamente distantes forem os grupos biológicos, maiores serão as diferenças nas letrinhas dos genes, consequentemente, quanto mais próximos filogeneticamente, maior a semelhança entre essas sequencias.

A aquaporina representa, assim como diversas outras moléculas (proteínas e enzimas), um bom exemplo de homologia. Não basta olhar a função celular e estrutura molecular para dizer que é “perfeita” ou bonita, é preciso buscar a informação de sua síntese e compara-la com outros grupos biológicos. É nessa dinâmica comparativa que o D.I tem ficado para trás com seu argumento de Paley e suas preposições criacionistas, pois eles descrevem uma molécula como uma beleza criada, mas não refutam as homologias moleculares. Preferem atacar o conceito de informação genética que é bem consolidado no ambiente acadêmico e não fornecem uma proposta prática para tentar impor sua concepção de criação e projeto inteligente como ciência.

Sendo assim, aqui trataremos da função das aquaporinas e as homologias de subfamílias e família de gene na qual ela pertence.

Aquaporinas (AQPs) são proteínas integrais que facilitam o transporte rápido de água através das membranas celulares em todos os organismos. O papel fisiológico destas proteínas de canal de água é importante especialmente para as plantas, devido ao seu recrutamento contínuo de água (Chrispeels e Maurel 1994). É também importante em órgãos de condução de fluídos especializados de animais, tais como os rins, glândulas lacrimais e os pulmões, por causa de seu controle ativo da água (Echevarria e Ilundain 1998). Além disso, alguns defeitos genéticos em AQPs são conhecidos por provocar doenças graves em seres humanos, tais como diabete insípida nefrogênica, glaucoma e edema pulmonar (Lee et al, 1997).

Aquaporinas pertencem a uma grande família proteica chamada major intrinsic proteins (MIP), que inclui mais de 150 proteínas de canais de membrana (Froger et al, 1998). Os membros pertencentes desta família conservada são reconhecidos, principalmente, por similaridades de sequências e a presença de dois padrões ANP (Asp-Pro-Ala) (Park e Saier, 1996), e também pela sua capacidade de aumentar a permeabilidade da membrana à água (ou pequenas moléculas hidrofílicas tais como glicerol e ureia) em oócitos de anfíbios do gênero Xenopus. Também alteram a permeabilidade osmótica de lipossomas (vesículas esféricas formadas por bicamadas concêntricas de fosfolipídios que se organizam espontaneamente em meio aquoso) (Echevarria et al, 1993). Recentemente, a estrutura tridimensional de várias aquaporinas foi mapeada. Estas proteínas estão organizadas em seis hélices hidrofóbicas transmembranares inclinadas que delimitam um poro hidrofílico em que os padrões NPA ocorrem (Scheuring et al 1999).

Estrutura cristalográfica da aquaporina 1 (AQP1)

Estrutura cristalográfica da aquaporina 1 (AQP1)

Até agora, as relações evolutivas entre os membros da família das aquaporinas são baseadas principalmente em comparações de similaridade de seqüências (Froger et al 1998).

Além disso, tem sido proposto recentemente que uma nomenclatura consistente e classificação da família das AQPs deve ser embasada quanto a sua função, localização celular, e similaridade de sequência (Heymann e Engel, 1999). No entanto, a partir de uma perspectiva evolutiva, estes não são critérios válidos para estabelecer verdadeiras relações homólogas se não considerarmos as sequencias que as codificam. Comparações unicamente feitas com base nas similaridades de seqüências não conseguem distinguir claramente os diferentes níveis de relacionamento, e é evidente que a homologia dos diferentes grupos da subfamília pode ser baseada nas relações entre genes para criar análises filogenéticas, mas tmabém sua função (Abouheif, 1997), e não somente sobre sua função. É preciso uma análise completa, de função e relação entre sequencias de genes que codificam as proteínas aquaporinas. Sendo assim, é preciso analisar a função e a estrutura molecular de cada uma das moléculas relacionadas as aquaporinas e suas semelhanças sequencias gênicas.

Há uma análise detalhada das relações filogenéticas de 153 proteínas de canais relacionadas com a família MIP em eucariotos. Este estudo fornece um quadro evolutivo para interpretar a função, a distribuição de tecidos, e regulação hormonal dessa família. Usando métodos de inferência filogenética foram determinados grandes eventos de duplicação gênica que ocorreram durante sua evolução. Para determinar as diferenças de restrição evolutiva ao longo das AQPs, estimou-se as taxas de variação de aminoácidos em locais individuais, inferida com relação á frequência relativa de diferentes substituições de aminoácidos, além da constância das taxas de evolução de diferentes grupos parálogos (Zardoya & Villalba, 2000).

Genes parálogos são aqueles originados por duplicação antes ou depois da especiação e podem possuir, ou não, o mesmo papel biológico. Por outro lado, genes ortólogos, são aqueles  originados de um único gene do último ancestral comum entre as espécies, e frequentemente possuem o mesmo papel biológico dos ancestrais.

Outro estudo também demonstrou que a família das AQPs é formada por multigenes que são evolutivamente conservados, especialmente em espécies poliplóides, como o trigo. Padrões conservados existentes entre as subfamílias das AQPs apoiam essa afirmação (Pandey et al, 2013).

Utilizando uma identificação abrangente e computacional de 349 novas tags de seqüências expressas como uma fonte de perfil de expressão, os genes de AQPs em trigo foram detectados em 9 diferentes tecidos. Um modelo tridimensional da aquaporina de T. aestivum foi desenvolvido. E este é o primeiro relatório da análise estrutural da plasma membrane intrinsic protein (PIP). A identificação dos genes funcionais em trigo está se tornando uma importante linha de pesquisa, e pode nos ajudar a entender a base genética e molecular para o melhoramento genético de trigo e também fornecer os recursos genéticos funcionais para a pesquisa transgênica.

As relações filogenéticas dos genes da família da AQPs em diferentes espécies de plantas é usada para entender melhor a evolução e conservação de espécies de interesse econômico, além de elucidar as relações filogenéticas das plantas com base nos genes que codificam tais proteínas, incluindo, claro, o das aquaporinas (Pandey et al, 2013).

Para classificar sistematicamente as aquaporinas, uma árvore filogenética foi construída por meio de vários alinhamentos das sequências de proteínas de Vitis vinifera, Glycine max, B. distortion, Z. mays, O. sativa, Arabidopsis thaliana e H. vulgar. A análise filogenética confirmou que as AQPs de trigo identificadas poderiam ser classificadas em quatro grandes grupos ortólogos  altamente semelhantes as subfamílias de aquaporinas (Zardoya, 2015).

Eles são; a PIP (mencionada acima), a tonoplast intrinsic proteins (TIP), small membrane intrinsic proteins (SIP) e nodulin membrane intrinsic protein (NIP).

A subfamília NIP exibe 3 grupos distintos (NIP1, NIP2, NIP4). A subfamília PIP é dividida em 2 subgrupos (PIP1 e PIP2), mas tem uma ligeira divergência quando comparado com NIP, TIP e SIP. Isto pode ser devido ao ritmo mais lento da evolução da PIP em comparação com outros subgrupos.

Há 6 aquaporinas de arroz (com Arabidopsis e trigo) são agrupadas na subfamília NIP, 4 aquaporinas de trigo, 8 de Arabidopsis e 5 de arroz agrupadas na subfamília TIP.

Há somente 2 aquaporinas do trigo, 2 de arroz e 3 de Arabidopsis foram agrupadas na subfamília SIP, que foi confirmada como a menor subfamília de aquaporinas.

A subfamília PIP provou ser o maior entre todas os da subfamília de AQPs, com 10 PIPs de trigo, 10 de arroz e 12 de Arabidopsis. As subfamilias PIPs e PIS estão intimamente relacionadas (Pandey et al, 2013).

Filogenia com as principais sub-famílias relacionadas, com os genes de Aquaporinas. Clique para ampliar

Filogenia com as principais sub-famílias relacionadas, com os genes de Aquaporinas. Clique para ampliar

Como os resultados indicam, trigo, arroz e Arabidopsis mostram semelhança do número de AQPs em cada subgrupo. A análise filogenética realizada com base em homologias de AQPs revelou mais de 13 genes identificados e que foram claramente divididos em quatro subfamílias diferentes (PIP, SIP, PIN e TIP).

A análise do perfil de expressão dos genes tem seguido o padrão de expressão da família do gene de aquaporinas em resposta ao stress abiótico em diferentes tecidos de plantas em vários em estágios (Aroca et al, 2005). Para demonstrar a análise de expressão de numerosos genes em vários tecidos, foi realizada a análise de expressão gênica (Audic & Claverie, 1997) Os perfis de expressão variaram de acordo com as subfamílias de aquaporinas. São 5 genes da PIP (PIP1-1, PIP1, PIP2, PIP2-3 e PIP2-7), 6 genes de TIP (TIP2-2, TIP2-1, TIP2-3, TIP1-2, TIP3-1 e TIP4- 3), 3 de NIP (NIP1-1, NIP1-3, e NIP3-2) e claro,o das aquaporinas (AQP5, AQP3, AQP4, AQP2, AQP7) que foram analisados para comparar a abundância de  RNAm transcritos em vários tecidos (Pandey et al, 2013). O que novamente demonstra clara relação filogenética.

Aquaporinas estão presentes em todos os organismos vivos, e, portanto, eles fornecem uma excelente oportunidade para aprofundar os conhecimentos sobre o significado biológico e da evolução molecular por duplicações de genes, seguido de especialização funcional e estrutural. Com base na filogenia resultante, as proteínas AQPs foram classificadas em seis grupos parálogos principais: 1) as BPL, ou proteínas de canal de transporte de glicerol, que incluem AQP3 mamíferos, AQP7, AQP9 e várias parálogas de nematóides, um parálogo de levedura, uma de Escherichia coli; 2) GLP, aquaporinas que incluem AQP0 em metazoários, AQP1, AQP2, AQP4, AQP5, e AQP6; 3) PIPs, que incluem PIP1 e PIP2; 4)TIP, ou proteínas tonoplásticas intrínsecas das plantas, que incluem aTIP, gTIP e dTIP; 5) NODS, ou seja, nodulina de plantas; 6) AQP8s, ou aquaporina de metazoários com 8 proteínas.

Destes grupos, AQPs e PIPs e TIPs se agrupam. Três padrões são comuns a todos os membros da família: AEF (Ala-Glu-Phe), que está localizada no domínio N-terminal; e dois NPA (Asp-Pro-Ala), que estão localizados nos domínios do centro e C-terminal, respectivamente. Outros resíduos são encontrados conservados dentro dos grandes grupos, mas não entre eles. Em geral, a subfamília PIP mostrou a menor variação e não foram identificados quaisquer substituições de aminoácidos que afetem as estruturas terciárias radicais, com a exceção de Ala → Ser na subfamília TIP (Zardoya & Villalba, 2000).

Em outro estudo foi analisado 55 sequências genética de MIP da planta Populus trichocarpa  e comparada com as de Arabidopsis, arroz e milho. A análise filogenética revela que Populus tem um quinto das subfamílias de X intrinsic proteins (XIPs). Modelos tridimensionais de todos as 55 MIPs foram construídos utilizando a técnica de modelagem por homologia. Filtros de seletividade para grupos aromáticos e argininas, características responsáveis pela seletividade de soluto e conservação de pequenos grupos residuais interfaciais foram analisados. A maioria dos não-XIP e MIPs são semelhantes à aquelas presentes em Arabidopsis, arroz e milho (Gupta & Sankararamakrishnan, 2009).

XIPs adicionais foram identificados a partir de pesquisa de banco de dados e 35 sequências estavam em dicotiledôneas, fungos, musgos e protozoários. Grupos de seletividade de aromáticos e argininas em XIPs de dicotiledôneas são mais hidrofóbicos em comparação com as proteínas XIPs de fungos e musgos. Portanto, eles são susceptíveis de transportar solutos hidrofóbicos. Quanto a seletividade de solutos, ela é maior em um dos subgrupos de XIPs de dicotiledoneas. A conservação de grupos residuais em XIPs de dicotiledoneas tem maior número de resíduos básicos. Observa-se a perda de introns em duas ocasiões: uma vez entre duas subfamílias de eudicotiledoneas e monocotiledônea, e a segunda quando XIPs de dicotiledoneas e musgo divergiram dos fungos (Gupta & Sankararamakrishnan, 2009).

Pode parecer inútil relatar essas relações filogenéticas entre XIP e MIP, mas devemos lembrar que MIP é a família de proteínas onde esta presente as AQPs com suas 4 famílias.

Vários relatos, incluindo estudos de fósseis e estimativas por relógio molecular têm evidenciado linhas evolutivas de plantas e animais para essas proteínas. Uma análise recente da sequência de proteína estimou que grandes linhagens de fungos estiveram presentes a mais de 1 bilhão de anos atrás e plantas terrestres apareceram após 3 milhões de anos (Page, 1996). A análise de MIPs de organismos primitivos para animais superiores pode ajudar a compreender a evolução dessas proteínas canais e seus mecanismos de transporte de diversos solutos no nível molecular. Análises de filtros de grupos aromáticos e argininas, seletividade e organização exon-introns de 34 XIPs a partir de fungos, musgos e plantas dicotiledôneas deu uma idéia sobre a evolução da subfamília de AQPs de fungos até plantas superiores. As estruturas aromáticas e de argininas, bem como de seletividade hidrofílica em fungos e XIPs de musgo indicam que as MIPs são susceptíveis ao envolvimento no transporte de solutos hidrofílicos incluindo água. O surgimento de plantas superiores poderia indicar maior diversidade nos solutos que são transportados (Gupta & Sankararamakrishnan, 2009).

Os aminoácidos aromáticos e argininas bem como filtros hidrófilos e seletividade dos fungos e XIPs de musgo foram substituídos por resíduos hidrofóbicos durante a divergência de plantas superiores e esta seletividade de filtro se tornou mais hidrofóbica nas XIPs de dicotiledôneas. Como resultado, os XIPs de dicotiledóneas são susceptíveis ao envolvimento em solutos que são mais hidrofóbicos do que os transportados pelos seus homólogos em fungos e musgo.

Sem homólogos de XIP encontrado em monocotiledôneas, pelo menos, os XIPs poderiam ter sido substituídos por algumas TIP e PIN com a seletividade a grupos aromáticos e argininas similares (Gupta & Sankararamakrishnan, 2009).

Desta forma, notamos que até mesmo aquaporinas, a menina de ouro dos proponentes do D.I no Brasil carece de evidências a favor do movimento e de fato, compartilha homólogos expressivos que favorecem o modelo atual, o da Teoria da evolução ao demonstrar que genes duplicados de aquaporinas e famílias e subfamílias inteiras delas são homólogos em eucariotos com o relógio molecular datando uma escala de milhões, e até bilhões de anos.

Existem outros artigos que suportam as relações filogenéticas da família MIP. Alguns deles são The MIP Family of Integral Membrane Channel Proteins: Sequence Comparisons, Evolutionary Relationships, Reconstructed Pathway of Evolution, and Proposed Functional Differentiation of the Two Repeated Halves of the Proteins e também Evolution of the MIP family of integral membrane transport proteins.

Victor Rossetti

Palavras chave: NetNature, Rossetti, Aquaporinas, Homologias, Filogênia, Familia MIP, Subfamilias, PIP, SIP, PIN e TIP.

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Referências

Chrispeels MJ, Agre P (1994) Aquaporins: Water channel proteins of plant and animal cells. Trends Biochem Sci 19:421–425
Echevarria M, Ilundaín AA (1998) Aquaporins. J Physiol Biochem 54:107–118
Echevarria M, Frindt G, Preston GM, Milovanovic S, Agre P, Fisch-barg J, Windhager EE (1993) Expression of multiple water channel activities in Xenopus oocytes injected with mRNA from rat kidney. J Gen Physiol 101:827–841
Lee MD, King LS, Agre P (1997) The aquaporin family of water channel proteins in clinical medicine. Medicine 76:141–156
Froger A, Tallur B, Thomas D, Delamarche C (1998) Prediction of functional residues in water channels and related proteins. Protein Sci 7:1458–1468
Park JH, Saier MH (1996) Phylogenetic characterization of the MIP family of transmembrane channel proteins. J Membr Biol 153:171–180
Scheuring S, Ringler P, Borgnia M, Stahlberg H, Mu¨ller DJ, Agre P, Engel A (1999) High resolution AFM topographs of the Escherichia coli water channel aquaporin Z. EMBO J 18:4981–4987
Heymann JB, Engel A (1999) Aquaporins: Phylogeny, structure, and physiology of water channels. News Physiol Sci 14:187–193
Abouheif E (1997) Developmental genetics and homology: A hierarchical approach. Trends Ecol Evol 12:405–408
Zardoya, R. Villalba, S. A Phylogenetic Framework for the Aquaporin Family in Eukaryotes. J Mol Evol (2001) 52:391–404 DOI: 10.1007/s002390010169
Pandey1,2, P. Sharma1, D.M. Pandey2, i. Sharma1 and r. Chatrath3. Identification of New Aquaporin Genes and Single Nucleotide Polymorphism in Bread Wheat. Evolutionary Bioinformatics 2013:9
Zardoya R. Phylogeny and evolution of the major intrinsic protein family. Biol Cell. 2005;97:397–414.
Aroca R, Amodeo G, Fernandez-Illescas S, Herman EM, Chaumont F, Chrispeels MJ. The role of aquaporins and membrane damage in chilling and hydrogenperoxide induced changes in the
Audic S, Claverie JM. The significance of digital gene expression profiles. Genome Res. 1997;7:986–95.
Gupta & Sankararamakrishnan. Genome-wide analysis of major intrinsic proteins in the tree plant Populus trichocarpa: Characterization of XIP subfamily of aquaporins from evolutionary perspective. BMC Plant Biology 2009, 9:134  doi:10.1186/1471-2229-9-134
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