TRANSFERÊNCIA ENDOSSIMBIÓTICA DE GENES – COMO MITOCÔNDRIAS, PLASTÍDIOS E CLOROPLASTOS FORJARAM OS GENOMAS DE EUCARIÓTICOS.

Seqüências do genoma revelam que um dilúvio de DNA de organelas tem constantemente bombardeado o núcleo celular desde o começo da endossimbiose. Experiências recentes têm demonstrado que o DNA é transferido de organelas para o núcleo a frequências extremamente altas. A transferência endossímbiótica de genes (TEG) é um processo onipresente, contínuo e natural que permeia a dinâmica do DNA nuclear. Este fluxo incessante de genes entre organela-núcleo permitiu maior autonomia e maior complexidade nuclear forjando grande parte do genoma eucarioto.

Mitocôndria

Mitocôndria

Genomas nucleares eucarióticas têm sido o endereço certo das doações de DNA feitas por mitocondria (DNAmt) e de cloroplastos (DNAcp). Essas transferências têm historicamente expandido o genoma, e claro sua complexidade. Os sinais da origem dos cromossomos podem ser vistos através da TEG que são evidências inconfundíveis em genomas sequenciados (Timmis et al, 2004).

Faz 2 bilhões de anos desde que surgiram os primeiros eucariotas. Muitos genes foram realocados a partir dos genomas organelares ancestrais para o núcleo. Muitos deles se tornaram cópias nucleares funcionalmente competentes que agora dirigem a biogênese de mitocôndrias e cloroplastos, enquanto outros têm evoluído para controlar processos celulares muito mais essenciais. O remodelamento das cópias de genes nas versões nucleares tem roubado funções das versões ainda presentes na organela, especialmente vias bioquímicas que foram transferidas das organelas para o citosol. Em mitocondriais e plastídios os genomas foram reduzidos em tamanho e ainda permenecem nesssa dinâmica 2 bilhões de anos depois da origem dos eucariotos.

Projetos de seqüenciamento do genoma têm descoberto transferências de genes organela-núcleo em taxas bastante altas e que somente agora se tornou algo mensurável em laboratório. As organelas eucarióticas contêm genes com um modo de herança não-Mendeliano (Mereschkowsky, 1999).

Esse fenômeno não era conhecido até a década de 1970, quando começaram a notar que organelas engolfadas por procariontes criaram situações endossimbioticas que poderiam dar origem as mitocôndrias a partir das α-proteobacterias, bem como em células vegetais a partir de ancestrais de cianobactérias. Com as comparações de seqüência inequivocamente identificadas ficou claro que tais grupos eram os ancestrais das mitocôndrias e cloroplastos (Weeden, 1981).

Os genomas nucleares da maioria dos organismos eucariotos são diplóides e são caracterizadas por herança por reprodução sexuada. Os genes nucleares vêm em pares alélicos. Gâmetas que resultam da meiose são haplóides e transportam apenas um único alelo (No esquema abaixo os alelos A B e C partir do progenitor feminino e a, b e cvem do progenitor masculino). O zigoto que resulta da fertilização herda um alelo nuclear década um dos pais (Aa, B e Cc). Em contrapartida, as organelas citoplasmáticas contêm caracteristicamente múltiplos genomas, homogêneos que são geralmente herdados de um dos pais. No esquema acima, mais comumente o doador é a fêmea. Em tabaco e muitas outras plantas, os genomas de mitocondriais e cloroplastos são especificamente degradados antes da fertilização (cruzes vermelhas).

Os genomas nucleares da maioria dos organismos eucariotos são diplóides e são caracterizadas por herança por reprodução sexuada. Os genes nucleares vêm em pares alélicos. Gâmetas que resultam da meiose são haplóides e transportam apenas um único alelo (No esquema abaixo os alelos A B e C partir do progenitor feminino e a, b e cvem do progenitor masculino). O zigoto que resulta da fertilização herda um alelo nuclear década um dos pais (Aa, B e Cc). Em contrapartida, as organelas citoplasmáticas contêm caracteristicamente múltiplos genomas, homogêneos que são geralmente herdados de um dos pais. No esquema acima, mais comumente o doador é a fêmea. Em tabaco e muitas outras plantas, os genomas de mitocondriais e cloroplastos são especificamente degradados antes da fertilização (cruzes vermelhas).

As minúcias do processo de TEG são mais complexas do que inicialmente se acreditava. Trata-se de um processo genético, bioquímico dinâmico e contínuo. Algumas organelas citoplasmáticas contém um conjunto minúsculo de genes em comparação com o genoma nuclear. Ambos, os cloroplastos e mitocôndrias, contêm múltiplos genomas circulares haplóides que estão presentes como monômeros e multímeros.

Genomas plastidiais codificam cerca de 20 a 200 proteínas (Simpson & Stern, 2002) enquanto genomas mitocondriais codificam algo entre 3 e 67 proteínas (Gray et al, 1999).

Os genomas mitocondriais são incomumente compostos por muitos cromossomos lineares, com poucos genes em cada deles (Burger et al, 2003). Há casos em que o genoma mitocondrial está ausente (Embley et al, 2003).

De modo parecido, moléculas de DNA circular com apenas um gene foram identificadas em alguns plastídios (Zhang et al, 1999) e em alguns casos, o plastídio desapareceu por completo (Hannaert et al, 2003). Estes, são as organelas mais diversificadas no que diz respeito a endossimbiose (Cavalier-Smith, 2000).

Do ponto de vista da diversidade genômica, as organelas em si são bioquimicamente muito diversificadas. Algumas mitocôndrias consomem oxigênio, algumas produzem hidrogênio (hidrogenossomas) (Embley et al, 2003) Algumas produzem ATP, com ou sem oxigênio (Tielens et al, 2002), outros tipos são extremamente reduzidos (mitossomas) e não produzem ATP em suas vias, mas ao invés disto produzem conjuntos de ferro-enxofre a célula (Tovar et al, 2003).

A moderna α-proteobacteria Mesorhizobium loti detém 7Mb de DNA que codifica mais de 6.700 proteínas. Seu parente Bradyrhizobium japonicum contém um genoma de 9,1Mb e mais de 8.300 proteínas. A cianobactéria Nostoc PCC 7120 tém um genoma de 6,4Mb que codifica cerca de 5.400 proteínas, enquanto que a Nostoc punctiforme é de cerca de 9Mb e codifica mais do que 7.200 proteínas (Timmis et al, 2004).

Comparando esses tamanhos de genoma com aqueles de organelas é possível ter dimensão da magnitude da redução genômica em organelas e como isso afeta suas funções.

Embora parasitas microbianos também tenham genomas muito reduzidos, tal processo em parasitas é fundamentalmente diferente a redução de genoma em organelas. Em parasitas ocorre a perda de genes e de suas funções. No caso de organelas ocorre a perda de genes, mas não de funções, uma distinção muito raramente destacada pelos cientistas.

Sem título

Com as análises comparativas atuais podemos contabilizar quantos genes e de quais tipos foram transferidos da organela para o núcleo, como ocorreu a transferência e quantas vezes isso ocorreu. Duas categorias de análises comparativas podem abordar estas questões.

A primeira busca identificar cópias de genes que ainda estão presentes no genoma de uma organela e em outros compartimentos da mesma célula, eventualmente indicando o processo de deslocamento do DNA e identificando evolutivamente o momento destes eventos.

A segunda categoria de constatação de transferência é baseada em análises de genomas nucleares, genomas de organelas e os genomas de procariotas candidatos antepassados ​​ que possam identificar genes no núcleo que já não estão presentes nas organelas mais antigas.

E algumas transferências evolutivamente recentes podem ser mostradas por comparações genômicas.

De fato, DNAcp foram encontrados no genoma mitocondrial do milho (Stern & Lonsdale, 1982). Isso mostra que sequencias de DNAmit e de cloroplastos forjaram o DNA nuclear (Jacobs et al, 1983), demonstrando a promiscuidade dessas moléculas.

Cópias completas de DNAmit foram descobertas também em genomas do gato e designou o termo “Numts” (acrônimo em inglês para nuclear integrants of mitochondrial DNA) para se referir a trechos nucleares de DNAmit. Esses Numts foram encontrados nos genomas nucleares de gafanhotos (Bensasson et al, 2000), primatas (Mundy et al, 2000 & Lu et al, 2002) e camarões (Williams et al, 2001). Por exemplo, o genoma de levedura contém intervalos com 80 a 100% de semelhança com DNAmit, que variam em tamanho de 22 a 230 pares de bases (pb) em 34 locais (Ricchetti et al, 1999). A divergência indica eventos de transferência recorrentes, dos mais antigos aos mais recentes. O genoma humano tem pelo menos 296 Numts diferentes entre 106bp e 14.654bp (90% do genoma mitocondrial) que cobrem os estudos DNAmit (Mourier et al, 2001).

Endossimbiose Simbiontes intracelulares que originalmente são descendentes de procariontes de vida livre tem sido importantes na evolução dos eucariotos, dando origem a duas organelas. As mitocôndrias surgiram a partir de α-proteobactérias e cloroplastos surgiu a partir de cianobactérias. Ambas tem contribuições importantes para o complemento de genes que são encontrados em núcleos eucarióticos hoje. Houve co-evolução do genoma da célula anfitriã com o dos endossimbiontes. O hospedeiro é geralmente aceito por ter uma afinidade com arqueobactérias, mas, os biólogos não concordam unanimemente quanto à sua natureza e a idade de quando surgiu sua organização intracelular, o seu estilo de vida bioquímica ou quantos tipos de genes que possuía o ancestral.

Endossimbiose Simbiontes intracelulares que originalmente são descendentes de procariontes de vida livre tem sido importantes na evolução dos eucariotos, dando origem a duas organelas. As mitocôndrias surgiram a partir de α-proteobactérias e cloroplastos surgiu a partir de cianobactérias. Ambas tem contribuições importantes para o complemento de genes que são encontrados em núcleos eucarióticos hoje. Houve co-evolução do genoma da célula anfitriã com o dos endossimbiontes. O hospedeiro é geralmente aceito por ter uma afinidade com arqueobactérias, mas, os biólogos não concordam unanimemente quanto à sua natureza e a idade de quando surgiu sua organização intracelular, o seu estilo de vida bioquímica ou quantos tipos de genes que possuía o ancestral.

Outros estudos computaram 612 inserções de DNAmit no genoma humano (Tourmen et al, 2002), um número muito grande devido a diferentes critérios de conservação e identificação da sequência de Numts são utilizados em estudos diferentes (Hazkani-Covo et al, 2003). Os Numts mais velhos são mais abundantes no genoma humano do que os mais recentes, indicando que o DNAmit pode ser amplificado somente depois de inserido (Hazkani-Covo et al, 2003) e muitos tendem a se repetir (Tourmen et al, 2002). Alguns Numts detectáveis ​​estão presentes em Plasmodium, alguns são altamente conservados foram identificados no genoma de Rattus norvegicus, Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, Schizosachharomyces pombe, Ciona intestinalis, Neurospora crassa e Fugu rubripes (Richly,200?).

Os genomas vegetais fornecem ainda mais evidências de DNA endossimbióticamente transferidos. O genoma nuclear de Arabidopsis sp contém uma grande inserção de DNAmit (cerca de 620kb) no cromossomo 2 (Lin et al, 1999 & Stupar et al, 2001), e um conteúdo extra de 7Kb distribuído entre 13 pequenos integrantes e 17 inserções de DNAcp, chamados de “Nupts” (acrônimo de nuclear integrants os plastid DNA) totalizando 11kb (Nature, 2000). No genoma do arroz, por si só o cromossomo 10 contém 28 fragmentos DNAcp com cerca de  80pb de comprimento, incluindo duas grandes inserções (Science, 2003).

Da mesma forma, o projeto de sequenciamento do cromossomo 1 do arroz mostra muitas inserções plastidiais (Shahmuradov et al, 2003). As inserções de  DNAmit também são abundantes no genoma do arroz. No cromossomo 10 há 57 desses segmentos que vão de 80 a 2552pb (Science, 2003)

Segmentos de DNA de organela são transferidos aos genomas aos fragmentos, e algumas vezes genomas completos são transferidos e permanecem presentes como componentes integrados de genomas eucarióticos (Timmis et al, 2004).

Da mesma forma que eventualmente genes ou genomas são transferidos em um sentido organela-núcleo, pode acontecer a perda de genes, especialmente os convergentes.

A eliminação de genes convergentes e substituição funcional dos genes da mitocôndria a partir de cópias que foram parar no núcleo chegou no grupo animal (Boore, 1999) com mitocôndrias codificando em média 12 ou 13 proteínas. Entretanto, o processo ainda continua ativamente ocorrendo em plantas superiores, que têm um número maior de proteínas mitocondriais. Estudos em angiospermas descobriram muitos casos de transferência que resultaram neste tipo de fenômeno. Por exemplo, o gene mitocondrial rps10 foi transferido de modo independente para o núcleo celular em muitos eventos de transferência e ativação mitocondrial (Adams & Palmer, 2003). Muitos parecem envolver recombinação em um promotor pré-existente envolvendo trânsito de regiões peptídicas (Brennicke et al, 1993).

Semelhante ao rps10, o gene do fator-1 de iniciação de tradução em cloroplasto (infA) também tem evidências claras de deslocamento e mobilidade (Millen et al, 2001). A relocalização deste gene de cloroplasto foi acompanhada por um decaimento da taxa mutacional e/ou a supressão da sequência. Entretanto, ao contrário rps10, a caracterização do gene nuclear infA indica o aparecimento de novo peptídio ao invés do parasitismo existente de genes.

Genes nucleares, como infA destacam que as perdas paralelas em linhagens independentes são ocorrências regulares na evolução do genoma do cloroplasto (Martin et al, 1998). Analisando o processo de redução ao longo do genoma do cloroplasto em função do tempo (como as perdas de genes de DNAcp) a filogenia mostra que as perdas paralelas em linhagens independentes superam as perdas únicas que são compartilhadas por linhagens descendentes (Martin et al, 2002). Então, a semelhança no conteúdo gênico entre genomas plastidiais contemporâneos é o resultado de uma imensa evolução convergente.

Existem transferências antigas que são mostradas por meio de comparações de genoma. Elas mostram genes que foram transferidos para o núcleo, mas não está mais presente na maioria dos genomas de organelas. Este tipo de constatação exige abordagens metodológicas diferentes.

Por exemplo, a Reclinomonas americana (Protista) tem o genoma mitocondrial com o maior conteúdo genético conhecido e possui homólogos de quase todos esses genes que foram encontrados no núcleo de outros eucariotas (Lang et al, 1997). Do mesmo modo, a maioria dos genes que estão contidos nos genomas de cloroplastos podem ser suas versões homólogas transferidas em genomas de plantas e algas (Martin et al, 1998).

Estudos comparativos mostraram também a transferência de genes durante simbioses secundárias – a origem dos plastídios de algas eucarióticas ao invés de cianobactérias – na evolução dos eucariotos (Henze et al, 1995). Uma busca por genes nucleares no genoma de Arabidopsis em árvores filogenéticas com homólogos de cianobactérias mostrou que aproximadamente 1.700 das 9.368 proteínas de Arabidopsis são suficientemente conservadas em sequência para permitir uma análise filogenética confiável. Sequencias que são provenientes de cianobactérias, indicando que aproximadamente 18% dos genes codificadores de proteínas em Arabidopsis são aquisições de plastídios (Martin et al, 2002). Muitos destes genes são adquiridos e acabam por controlar sistemas celulares ligados a biogênese do cloroplasto e são direcionados para o citosol ou para vias de secreção de eucariotas (Leister, 2003).

Foram identificadas 630 proteínas nucleares que se originaram a partir das mitocôndrias (Gabaldón & Huynen, 2003), dos quais cerca de 30% foram parecem ser direcionados para as mitocôndrias, leveduras e humano. Assim, as proteínas codificadas por vários genes nucleares são derivadas a partir de DNA de organelas em última análise e levam consigo novas funções a novos compartimentos. Amplas análises de genoma (Leister, 2003 & Brown, 2003) mostram que a relação entre as importações de genes via organela-núcleo é difícil de prever.

Em A rabidopsis, menos de metade das proteínas que são identificáveis ​​como aquisições de cianobactérias são previstas para ser direcionada para cloroplastos. Muitas são direcionadas para o citosol, a via de secreção ou da mitocôndria.

Por outro lado, uma proporção semelhante de proteínas que são direcionados para o plastídio não parecem ser adquiridas a partir cianobactérias (Liste et al, 2003). Assim, produtos de genes nucleares que são frutos de endossimbiontes estão livres para preencher novos padrões de compartimentalização na célula (Lang et al, 1999). Além disso, as doações de genes de organelas muitas vezes levam a substituição funcional de genes pré-existentes do hospedeiro e funcionalmente equivalentes, um processo conhecido como realocação endossimbiótica de genes (Brown, 2003).

O número de proteínas que estão previstos para serem importados para dentro da mitocôndria varia marcadamente entre grupos eucarióticos, indo 150 proteínas no fungo parasita Encephalitozoon cuniculito eté 4.000 proteínas em humanos. Somente 50 proteínas eram comuns entre mitocôndrias e todos os eucariotos não-parasitários (Richly et al, 2003) .

Nos caminhos bioquímicos que estão presentes tanto no hospedeiro original quanto em seus endossimbiontes a concorrência pode ocorrer (Martin & Schnarrenberger, 1997). Em alguns casos, a via do simbionte pode predominar (Lange et al, 2000), mas as vias híbridas podem desenvolver tanto acolhimento quanto a endossimbiose (Aravind et al, 2003).

A divisão de organelas é um bom exemplo de mistura de linhagens específicas e combinação de funções endossimbioticamente herdadas recém-evoluídas bioquimicamente (McFadden & Ralph, 2003) em eucariotas.

O citosol é um local dinâmico e influente na evolução eucariótica. Quando os genes são doados via organela-núcleo, não há nenhum dispositivo que direciona automaticamente o produto de volta da proteína para doador. Em vez disso, o acaso e a seleção natural (notemos que acaso não é a mesma coisa que seleção natural) e a diversificação de linhagens parecem reger o destino intracelular e a segmentação de genes que organelas doaram para os cromossomos de seus hospedeiros. Neste sentido, as doações de genes de organelas são materiais de partida importante para a evolução de novos genes que são específicos para as linhagens eucarióticas.

Transferências de genes têm ocorrido em diferentes momentos no passado, e indicam que o processo permanece em andamento. O desafio tem sido obter estimativas empíricas diretas da freqüência na qual o DNA esta sendo transferido entre compartimentos celulares.

Na levedura, um plasmídeo recombinante que foi introduzido em uma mitocôndria mostrou-se migrando para o núcleo como um epissoma (isto é, sem ser recombinado no DNA nuclear) a uma frequência de 2 x 10-5 por célula por geração (Thorsness & Fox, 1990). A frequência mais baixa (5 x 10-6 per célula por geração) foi observada quando o plasmídeo foi integrado no cromossomo (Thorsness & Fox, 1993).

Nas mitocôndrias destas experiências, o DNA epissomal foi libertado, o que indica que a libertação do DNA a partir da mitocôndria de levedura é frequente, mas a integração pode ser rara em núcleos de levedura porque exige um elevado grau de confiança na recombinação homóloga para o trabalho de incorporação do DNA. Os mais novos indicam que o escape do DNAmit em levedura ocorre através de um mecanismo intracelular que depende majoritariamente da composição do meio de crescimento e das condições do genoma mitocondrial, além de ser independente de intermediários de RNA (Shafer et al, 1999).

A transferência de genes dos Cloroplastos para plantas superiores e algas.

Para testar, e determinar a frequência da transferência de DNA de plastídios e recombinação integradora no genoma nuclear de plantas superiores, o plastoma do tabaco foi alterado alterado com o uso de um gene de fosfotransferase de neomicina (neoSTLS2) que foi adaptado para expressão apenas no genome nuclear (Huang et al, 2003). Em 16 das 250.000 mudas, o marcador neoSTLS2 tinha sido integrado no cromossomo nuclear, cada vez em um local diferente, o que equivale a transferência de um gene a cada 16 mil gametas.

A mitocondria de eucarióticas é derivado de um ancestral endossimbiótico de uma α-proteobactéria, e a maioria dos genes que estavam originalmente presentes no genoma deste antepassado foram transferidos para o núcleo (seta preta). Apenas um pequeno número está sendo retido na organela (círculo azul). Do mesmo modo, a maior parte dos genes do antepassado endosimbionte do cloroplasto foram também transferidos para o núcleo (seta preta). Então, como resultado, organelas citoplasmáticas são fortemente dependentes de genes nucleares que importam mais de 90% de suas proteínas do citoplasma (setas brancas). As setas tracejadas indicam o DNA mitocondrial (azul) e cloroplasto (verde). Sequencias de cloroplastos e nucleares também são encontradas no genoma mitocondrial, mas pouco ou nenhum DNA promíscuo está localizada no cloroplasto.

A mitocôndria de eucarióticas é derivado de um ancestral endossimbiótico de uma α-proteobactéria, e a maioria dos genes que estavam originalmente presentes no genoma deste antepassado foram transferidos para o núcleo (seta preta). Apenas um pequeno número está sendo retido na organela (círculo azul). Do mesmo modo, a maior parte dos genes do antepassado endossimbionte do cloroplasto foram também transferidos para o núcleo (seta preta). Então, como resultado, organelas citoplasmáticas são fortemente dependentes de genes nucleares que importam mais de 90% de suas proteínas do citoplasma (setas brancas). As setas tracejadas indicam o DNA mitocondrial (azul) e cloroplasto (verde). Sequencias de cloroplastos e nucleares também são encontradas no genoma mitocondrial, mas pouco ou nenhum DNA promíscuo está localizada no cloroplasto.

A diversidade de locais de inserção indica que o marcador pode ser transposto durante processos meióticos e pós-meióticos, ou durante a formação do gâmeta masculino porque a um único evento de transferência que é subsequentemente amplificado por divisão das células somáticas conduziria ao mesmo local de integração sendo encontrado em todas as plantas com cloroplasto (Huang et al, 2003).

Nessas integrações de DNA induzidas por transformações de biobalística, as transferências não mostram nenhuma preferência particular por locais de recombinação em ambos os genomas nucleares ou plastidiais.

Doze plantas altamente resistentes foram regeneradas com o uso alguns antibióticos, onde 11 mostraram herança mendeliana de fenótipo resistente. Depois de uma aproximação sobre o número de células regeneráveis ​​que estavam presentes nas folhas, uma frequência de transposição de cloroplasto-núcleo em um evento em cinco milhões de células somáticas foi estimados (Stegemann et al, 2003). A frequência em células somáticas foi por volta de 300 vezes menor que em gametas masculinos da mesma espécie (Huang et al, 2003). A degeneração programada dos plastídios ocorre durante o desenvolvimento de grãos de pólen.

Após os genomas de cloroplastos serem degradados, o DNA fragmentado pode tornar-se disponível e capaz de transferir-se. Em leveduras, uma taxa aumentada de escape de DNAmit para o núcleo tem sido associada ao aumento de degradação anormal da mitocôndria (Campbell & Thorsness, 1998).

Algo muito parecido ocorre em animais quando têm uma linha germinal sequestrada.  A transferência de sequências mitocondriais para o núcleo pode ocorrer mais provavelmente durante a degeneração mitocondrial no esperma, seguido da fertilização (Woischnik & Moraes, 2002).

Em algas, os estudos geralmente usam Chlamydomonas reinhardtii. Em um estudo particularmente, 13 bilhões de células haplóides foram rastreadas, mas nenhuma transferência de DNA cloroplasto-núcleo foi detectada. Esta constatação implica uma transferência de pelo menos seis ordens de grandeza menor do que em plantas superiores, o que é consistente com a escassez de DNAcp integrado no genoma nuclear de C.reinhardtii (Liste et al, 2003). A presença de um cloroplasto nesta alga pode explicar essa diferença: se a lise dos cloroplastos e subsequente degradação do genoma são necessárias para a transferência de genes endossimbióticos, os organismos com apenas um cloroplasto essencial não sobreviveriam. No entanto, a degradação específica de DNAcp em C.reinhardtii ocorre durante a formação do zigoto na fertilização. Seria interessante em trabalhos futuros determinar esse tipo de transferência.

Mecanismos, restrições e transferência

Os dados aqui apresentados fornecem evidências de como muitas vezes o DNA é transferido entre compartimentos celulares.

Nos estudos pré-genômicos de sequenciamento, a maioria dos numts e nupts tiveram cerca 95% da identidade de nucleotídios dos genes de organelas homólogos, provavelmente porque a maior parte destas sequências são rapidamente eliminadas para o núcleo ou talvez porque as regiões com baixa homologia não foram procuradas. A falta de divergência nos numts e nupts mais conhecidos indica que eles devem ter sido transferidos para o núcleo recentemente.

Mas uma pergunta ainda intriga; como genes de organela fisicamente vão no núcleo e recombinar com DNA cromossômico?

Há dois pontos de vista, duas hipóteses, opostas e debatidas sobre como os genes são transferidos. Eles se baseiam em diferentes observações e são chamados de “DNA em massa” e “intermediários DNAc”.

O modelo de “DNA em massa” é baseado em um método comparativo, (Thorsness & Weber, 1996) usando o genoma de levedura e sequencias de comparação. Nesse modelo a recombinação entre moléculas de DNA de organelas e de cromossomas nucleares é o mecanismo de transferência de genes, seguido por um processo de recombinação genética (Henze & Martin, 2001). As evidências deste tipo de transferência já foram encontradas em situações experimentais usando leveduras (Thorsness & Weber, 1996). Em comparações feitas entre DNA de organela e nuclear da mesma espécie (numts e nupts), as regiões espaçadoras intergênicas não codificantes do DNA de organela são encontradas em cópias nucleares transferidas tão frequentemente quanto ás sequências que são codificantes (Lopez et al, 1994 e Mourier et al, 2001 e Lin et al, 1999 e Science, 2003).

Quando moléculas inteiras de DNA organelar (com cerca de 100kb de comprimento) são encontradas recombinadas em cromossomos eucarióticos contendo os íntrons organelares, os tRNAs e centenas de kb de regiões organelares não-codificante (Lin et al, 1999) fazem a transferência em massa de grandes quantidades de DNA (Henze & Martin, 2001).

A visão de “intermediários de DNAc” sustenta que mRNAs de DNAs complementares (DNAc) de são veículos de transferência de genes de organelas para os núcleos (Brennicke et al, 1993 Adams et al, 2002). Ele baseia-se em estudos de amostragem em plantas com flores, em que os genes que estão presentes no DNAmit de algumas espécies são procurados entre muitas outras espécies para identificar a perda dos genes no DNAmit, acompanhados pela ocorrência de uma cópia funcional no DNA nuclear (Brennicke et al, 1993 & Adams & Palmer, 2003).

Como genes codificadores de proteínas mitocondriais de angiospermas muitas vezes têm íntros e o RNA deles passa por um processo de edição (splicing), a inferência tem sido que os intermediários de DNAc editados e emendados estão diretamente envolvidos no processo de transferência física (Brennicke et al, 1993 Adams et al, 2002). No entanto, existem interpretações alternativas para as observações dos intermediários DNAc. Pode ser que quando o DNAc é editado e emendado, as transcrições em mitocondriais de planta devem ocorrer e assim ser mais propensas a se recombinar com DNAmit apagando locais editados e íntrons no gene mitocondrial (Henze & Martin, 2001).

A dinâmica do DNAc mediada pela perda de íntron e locais editados em DNAmit de planta pode imitar intermediários de sequências de DNAc, mesmo que o DNA em massa só for fisicamente transferido para a recombinação no núcleo (Henze & Martin, 2001).

Adicionando a isto, temos a natureza complexa do florescimento dos genomas DNAmit, que parece ser uma mistura heterogênea de moléculas de DNA que são menores do que a cópia mestra (Brennicke et al, 1993).

Embora haja possibilidade de “intermediários de DNAc” estarem envolvidos, a transferência de genes de mitocôndrias para o núcleo em angiospermas não pode ser excluída, como é muitas vezes sugerida (Brennicke et al, 1993 e Adams et al, 2002 e Adams et al, 2002). Existem interpretações alternativas dos mesmos dados (Henze & Martin, 2001).

Em uma escala mais ampla, as evidências implicam que o “intermediários de DNAc” são transferidos em DNAmit para outros grupos de plantas com flores. A transferência de DNA em massa encontra apoio em comparações genômicas (Ricchetti et al, 1999 e Shahmuradov et al, 2003) e estudos experimentais de fluxo de genes entre organela-núcleo em leveduras e plantas superiores (Thorsness & Fox, 1990 e Campbell & Thorsness, 1998). Na evolução inicial das mitocôndrias e cloroplastos, onde o peso da TEG ocorre (Gray et al, 1999 e Martin et al, 2002) “intermediários de DNAc” teriam sido desnecessários porque a edição e íntrons em α-proteobacterias e cianobacterias vida livre são extremamente raros na melhor das hipóteses.

Não há evidência nos genomas de organelas de que o DNA é integrado em regiões cromossômicas preferencialmente. Cerca de 98% de todos os numts são integrados em sequências que não são genes potenciais, os restantes 2% estão em íntrons (Woischnik & Moraes, 2002). A integração de DNAmit levou a mutações somáticas humanas que estão ligadas a formação de tecidos com anormalidade (neoplasmas) (Shay & Werbin, 1992), e há apenas um caso de um numt causando mutação hereditária (Turner et al, 2003). O momento e o local desta inserção coincidiu com o acidente de Chernobyl (Turner et al, 2003) na explosão do reator nuclear, indicando que a fragmentação do DNAmit foi induzida por radiação (ou pela recombinação envolvendo numts pré-existentes) pode ter sido envolvido.

A evidência foi encontrada agrupamento de genes que estão envolvidos no processamento de ácidos nucleicos mitocondriais em Arabidopsis (Elo et al, 2003), mas é improvável que o agrupamento reflita uma relíquia ancestral da organização do genoma mitocondrial. Do ponto de vista da transcrição, a evidência foi encontrada em grupos importantes de genes nucleares que respondem ao estado fisiológico do plastídio em Arabidopsis.

A observação de que 1 em 16.000 gametas masculinos em tabaco contém um novo integrante DNA plastidial levanta questões interessantes sobre como genomas nucleares de planta não estão transbordando com tais sequências.

Um processo de eliminação seqüêncial deve contrabalançar tantas inserções. O sequenciamento do genoma revelou que, embora as sequências de organelas que estão presentes no genoma nuclear variem em idade e tamanho, a maioria é muito semelhante aos seus homólogos organelares. De fato, em alguns casos acabam tendo cerca de 95% de identidade de sequencial (Timmis et al, 2004).

Se a eliminação sequência promíscua for lenta, seria de esperar que a maior parte destas sequências seriam altamente divergentes. Estes dados indicam um volume elevado de sequências de organelas no núcleo que é bastante conservado e pode ser observado em sequencias intergênicas não-essenciais (Devos et al, 1997), mas com eventos de recombinação  ocasionalmente acabam ocorrendo, levam a seleção e fixação dele como um gene funcional (Martin, 2003).

Outra questão importante que foi levantada neste estudo era em relação a quantificar a contribuição do contínuo fluxo de DNA organelar para aumento de variação genética no genoma nuclear.

Ao contrário de elementos transponíveis (transposons), as sequências do fluxo organela-nucleo não podem sofrer transposição autônoma, o que provavelmente explica a sua “modesta” colonização no genoma nuclear em comparação com a obtida por transpósons. Sendo assim, se as taxas de transferência que foram calculadas são típicas, um em cada poucos milhares de plantas que vemos na natureza possui um novo pedaço de DNAcp em seu núcleo que adquiriu na geração anterior (Huang et al, 2003) em uma frequência que pode ser comparada com a taxa de mutação do DNA nuclear (Stegemann et al, 2003 & Martin, 2003).

Além de seu papel central na evolução do genoma eucariota, a TEG também é relevante no debate que diz respeito à contenção do compartimento genético do cloroplasto geneticamente modificados.

Sem título

Redução do genoma do cloroplasto ao longo do tempo. Sabemos que os plastídios tem sua origem datada em 1,2 bilhões de anos, porque algas vermelhas fósseis datam essa idade. O ancestral de plastídios era uma cianobactéria de vida livre e, portanto, deve ter possuído vários milhares de genes como seus contemporâneos. Após a invenção de um aparelho de importação de proteínas de plastos (um pré-requisito para realocar os genes que codificam as proteínas necessárias pela organela para o núcleo), plastídios abandonaram mais dos seus genes para o genoma da sua célula hospedeira. Este processo de realocação maciça de gene ocorreu no início da endossimbiose e continuou em paralelo durante a diversificação de algas, mas o mesmo conjunto básico de genes para a fotossíntese (e tradução proteica) foi mantido em todas as linhagens. O tamanho das barras apresentadas indica o tamanho do genoma de cloroplastos de uma diversidade de linhagens de plantas, a partir de algas vermelhas (Porphyra) para angiospermas (plantas com flores) e Cyanophora (pertencentes à mais antiga linhagem de eucariotos fotossintéticos), e seus parentes de cianobactérias de vida livre (cianobactérias). A redução no tamanho do genoma do cloroplasto foi mapeada sobre uma árvore filogenética das relações entre estes genomas. Os números no fim dos ramos indicam o número de genes que estão presentes nos respectivos genomas. Estes genes são divididos em três categorias funcionais que são representados pelas três cores diferentes que formam as barras.

As estimativas elevadas para a transferência entre cloroplasto-núcleo (Huang et al, 2003 & Stegemann et al, 2003) põem em dúvida a alegação de que cloroplastos transgênicos podem ser contidos de forma confiável na maioria das culturas de plantas rigorosas através da estrita herança maternal. Isso provoca outro debate voltado a questões estratégicas de biotecnologia agrícola e bioética que se concentram em DNAcp. Para essas descobertas as principais questões no momento são voltadas para a transferência e entender se ela é um “capricho” da evolução que afeta a árvore da vida ou se é um mecanismo que forjou eucariotas a partir de procariotos.

A resposta para este tipo de pergunta depende da quantidade de genes eucariotas adquiridos a partir de sua mitocondrial e de seu cloroplasto (Martin & Russell, 2003 & Doolittle et al, 2003), além claro, dos genes que os procariontes doadores possuíam.

A biologia atual ainda vê o parentesco de procariotas e eucariotas como algo determinado pela árvore universal de 3 domínios de Carl Woese, a qual nos induz (ainda que incosncientemente) a crer que eucariotas são um grupo a parte e especial que deve possuir genes que são de origens archaebacterial (Woese et al, 1990).

Esta visão está se tornando mais insegura, especialmente depois que Rivera et al (105) descobriu que cerca de 2/3 dos genes das leveduras eram homólogos a procarióticos identificáveis ​​são mais semelhantes aos homólogos eubacterianos do que homólogos archaebacterial. E claro, ao grupo TACK+Lokiarchaeota que demonstra que eucariotos podem ser o resutado quimério entre eubactérias e archeas (Veja aqui e aqui).

Entender como tantos genes de origem eubacterial veiram residir no genoma nuclear de eucarióticas por TEG é um estudo contínuo. No geral, há duas correntes que competem entre si.

Em um canto temos a proposta baseada na “visão mitocôndrial” de que todos esses genes semelhantes com eubacterias derivam do genoma ancestral de mitocôndria. Em outro extremo, temos a “visão lateral” em que a contribuição global dos genes da mitocôndria é pequena e que várias linhagens eucarióticas adquiriram genes eubacterianos através de uma linhagem específica que doou via transferências laterais de genes ou de um simbionte no passado antigo que ainda não identificamos.

A principal dificuldade com a proposta que usa as mitocôndrias é que a maioria dos genes semelhantes ás eubacterias no genoma eucariótico não ramificam-se especificamente com homólogos de α-proteobacteria.

A “visão mitocondrial” requer algumas deduções que sejam no mínimo defensáveis. Primeiro porque a filogenia de genes são imperfeitas, produzindo ramos errôneos por razões matemáticas (Martin et al., 2002 e Penny et al, 1982 e Rokas etal, 2003). E também porque a amostragem é incompleta (isto é, mais genomas de α-proteobacterial podem fornecer um quadro mais amplo) (Wu et al, 200?); e claro, a transferência lateral de genes entre procariontes nos últimos 2 bilhões anos (portanto, desde a origem da mitocôndria) tem misturado os genes de procariontes de vida livre, confundindo assim as árvores (Gogarten et al, 2002). Há ainda uma última variável nessa análise; quando os genes são transferidos de organelas para o núcleo, são submetidos a uma fase na qual adquirem algumas mutações estranhas antes que se tornem totalmente funcionais. Isso pode alterar a sua posição na filogenia (Schnarrenberger & Martin, 2002).

A principal dificuldade da visão que se baseia em transferência lateral de genes é a falta de evidência direta de genomas eucarióticos em seu favor. A análise inicial da seqüência do genoma humano indicou que transferências laterais de genes (TLG) de procariontes de vida livre para eucariotas é generalizada. Amostragens mais amplas de linhagens eucarióticas mostraram que a evidência inicial estava longe de ser conclusiva (Brown, 2003). Considerando que a amostra de genomas (especificamente entre os eucariontes, cianobactérias e α-proteobactérias) ainda é extremamente pequena é de se esperar inconclusividade.

Além do que, não parecem ser aquisições específicas nas linhagens eucariotas, como as recentes descobertas atestam (Doolittle et al, 2003 & Gogarten et al, 2002). A maioria das evidências que favorecem a TLG em eucariontes é baseada no conflito de árvores (Archibald et al, 2003) enquanto que a teoria e a prática indicam que árvores em conflito precisam esperar por mais dados (Penny et al, 1982 & Rokas et al, 2009).

O argumento de que simbiontes misteriosos do passado antigo doaram genes eucariotas tomou recentemente um golpe. Simbiontes misteriosos ajudaram a explicar como eucariotas “primitivos” que foram vistos como sem mitocôndrias, como a Giardia intestinalis, poderia ter obtido o seu genes eubacterianos (Hedges et al, 2001 e Hartman & Fedorov, 2002). No entanto, novos dados mostram que a Giardia não é primitiva (Embley et al, 1998 e Stechmann & Cavalier-Smith, 2002), e que tem mitocôndrias (Tovar et al, 2003) e assim uma possível origem mitocondrial de genes eubacterianos.

No apanhado geral, a evidência do crescente número de seqüências do genoma de eucarióticas pode favorecer a visão mitocondrial nesse elenco de pontos de vista, com considerações e variáveis.

Há muitas evidências de fragmentos integrados de DNA de organelas, mas não há relatos de segmentos de cromossomos bacterianos integrados que surgiram a partir sequencias de outros genomas (Martin, 2003). Nem mesmo Drosófila, que abriga a simbiótica α-proteobacteria (Wu et al, 200?) como fruto de uma possível transferência em um inseto diferente, possui esta evidência (Kondo et al, 2002)

Assim, a transferência organela-núcleo parecer ser generalizada, contínua, real, abundante e total embora seja rara.

Um cálculo simples ilustra essa raridade. A soma de 800 inserções individuais de DNA de organela em genomas de leveduras, humanos e de Arabidopsis (no cromossomo 1 e 10 do arroz), totaliza 1,2Mb de DNA. Entretanto, não há nenhuma evidência relatada para todos os fragmentos do cromossomo de procariontes de vida livre nos genomas. De acordo com a contribuição da TLG de procariotas para o DNA de eucariótica na história evolutiva recente poderia ser inferida a partir de uma pequena amostra, que é, no máximo, 1/800. Isso dá a contribuição das organelas, e, no máximo 1/12000 de organelas em termos de comprimento de fragmentos de DNA integrados que são mais longos do que 100bp.

Em termos gerais, seu impacto sobre aqueles diretamente observáveis ​​em genomas de eucarióticas a TEG tende a ultrapassar a TLG.

Olhando para a eucariogênese, quando genomas de organelas eram tão grandes quanto o de seus ancestrais ​​procariotas, ou quando o genoma do hospedeiro faltava tudo o que ele mais tarde adquirido, um dilúvio de genes provenientes de organelas forjou o genoma eucariota. No momento em que as primeiras mitocôndrias ancestrais se fixaram endossimbioticamente em seu hospedeiro, não havia peptídios ou importação de máquinas proteicas para direcionar os produtos de genes transferidos (Neupert, 1997) de volta para as mitocôndrias.

As primeiras transferências da mitocôndria (uma primitiva Eubacterium) teriam enriquecido os cromossomos de archaebacteriais. Os produtos expressos poderiam ter sido alvo apenas para citosol e membrana plasmática do hospedeiro e não para as organelas em si (Martin & Müller, 1998)

Somente depois da importação de proteínas para dentro da mitocôndria ter ocorrido (e mais tarde, de forma independente para os cloroplastos) (Soll, 2002), foi que o processo de redução do genoma organelar começou a acontecer. Se em seus primórdios, a TEG era um mecanismo poderoso então a quimera com variação natural foi verdadeiramente única para a linhagem como um todo. Se observássemos os cromossomos procariotas eles certamente mostrariam possuir quase todos os atributos de cromossomos eucarióticos.

Victor Rossetti

Palavras chave: NetNature, Rossetti, Endossimbiose, Transferência endossimbiotica de genes, Transferencia lateral de genes, mitocôndrias, cloroplastos, plastídios, organelas, núcleo, cromossomo.

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Referências

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