CIENTISTAS DESENTERRAM PROTEÍNAS DO PASSADO.

Bioquímicos evolutivos estão tratando proteínas antigas como fósseis para contar suas histórias.

Explosão do passado - Para saber como proteínas de hoje evoluíram, os cientistas estão a reconstruindo moléculas antigas. Por: James Provost

Explosão do passado – Para saber como proteínas de hoje evoluíram, os cientistas estão a reconstruindo moléculas antigas. Por: James Provost

O vírus da gripe influenza é um artista de mudança rápida. Em poucas décadas, o seu genoma podem evoluir tanto como genomas de animais pode ao longo de milhões de anos. Isso significa que as proteínas virais, incluindo aquelas que alertar os nossos corpos para uma infecção, constantemente se reinventam, ameaçando nosso sistema imunológico e deixando os desenvolvedores de vacinas frustrantes.

Para Jesse Bloom, um biólogo que estuda como a evolução afeta proteínas, que a mudança implacável é uma oportunidade. Graças aos dados recolhidos durante as temporadas de gripe do passado, Bloom sabe a composição genética exata de alguns antepassados de vírus da gripe hoje. Seu grupo de laboratório do Centro de Câncer Fred Hutchinson de Pesquisa em Seattle usa essas informações para descobrir como os vírus fez suas transformações – esquivando-se da imunidade.

Bloom e outros são parte de um grupo crescente de cientistas que praticam a “bioquímica evolutiva.” Eles procuram explicar a tremenda diversidade da vida e determinar exatamente como essa diversidade surgiu. Ao invés de se concentrar em como plantas ou animais adaptaram a diferentes ambientes, no entanto, esses pesquisadores consideram a diversidade em uma escala muito menor: seu trabalho tem como objetivo explicar como o pequeno conjunto de proteínas que alimentado formas de vida primitivas evoluiu para os milhões de proteínas especializadas que conduziu os processos biológicos de hoje.

Explorando os registros genéticos, Bloom pode montar proteínas do vírus que existiam em tempos passados, em seguida, reconstruir como eles evoluíram, um aminoácido de cada vez. Outros pesquisadores estão analisando espécies modernas para ressuscitar as formas ancestrais de moléculas biológicas que evoluíram ao longo de milhões de anos.
Com uma proteína histórica na mão, os pesquisadores podem testar como trocar um único aminoácido – como a evolução poderia ter feito – muda a forma como a proteína dobra ou dobras e se conecta (ou não) com outras moléculas. Ao testar versões alternativas da história de uma proteína através de mudanças de aminoácidos passo a passo, os cientistas podem aprender a forma física de uma proteína tem tanto habilitado quanto constrangido a sua evolução.

Em última análise, este trabalho pode responder a algumas perguntas de longa data: Até que ponto a evolução dependem de eventos fortuitos? Evolução pode chegar ao mesmo ponto viajando por caminhos diferentes? Como é que a complexidade biológica evoluir? Tais experiências também estão ajudando os pesquisadores que estudam proteínas modernas a classificar como a ordem de aminoácidos refere-se a função biológica.

Forma é função

Essa série ordenada de aminoácidos é explicitado pelo gene que mantém o modelo para uma proteína. Uma vez que os aminoácidos adequados são amarrados juntos, eles dobram-se como origamis em estruturas minúsculas com cantos e saliências que determinam o que a proteína faz dentro de uma célula. A forma dobrada de uma proteína permite agarrar-se a pedaços específicos de DNA ou acelerar determinadas reações químicas. Mutações em um gene podem mudar a forma da proteína resultante ou alterar aspectos sutis de seu comportamento de modo que, ao longo do tempo, a função de uma proteína pode mudar. Mas as possibilidades não são infinitas. Novas proteínas que não conseguem dobrar ou não executam conforme necessário não sobrevivem aos testes da seleção natural.

“Os determinantes físicos desta dobragem, estabilidade, solubilidade, função e especificidade são aspectos absolutamente essenciais do processo evolutivo”, diz Universidade de Chicago biólogo Joe Thornton. “Isso não tem sido amplamente apreciado ou explicitamente dirigido até muito recentemente.” Agora, Thornton diz, é claro que para entender a evolução molecular, é importante estudar proteínas em seu funcionamento, como objetos físicos.
Como eles reconstruíram o passado das proteínas, os pesquisadores estão descobrindo que as mutações genéticas, por vezes, remodelam uma molécula apenas o suficiente para dar uma chance para outras mutações que teria falhado anteriormente. Isso cria oportunidades para novos recursos e funções para evoluir – uma ideia que os biólogos têm considerado há décadas, mas só agora começou a explorar no laboratório.

Source: L. Gong et al/eLife 2013

Source: L. Gong et al/eLife 2013

Bloom e seus colegas, por exemplo, usaram uma proteína do vírus da gripe chamada nucleoprotein para examinar como as interações entre mutações têm afetado a evolução global do vírus. Compreender os efeitos combinados de várias mutações poderia permitir os investigadores antecipar os efeitos de curto prazo da nova variação genética. Esse conhecimento pode ajudar a melhorar as previsões dos quais cepas virais são susceptíveis de circular em estações futuras de gripe, informações importantes para a concepção de vacinas eficazes.

Comparando genes da nucleoproteína de estirpes do vírus isolado em 1968 e 2007, a equipe de Bloom mapeou os passos mais prováveis pelo qual a proteína 1968 se transformou em sua forma mais recente. Embora nucleoproteína ainda desempenhe o mesmo papel que ele fez em 1968 – auxiliando na montagem de RNA viral – 33 dos seus 498 aminoácidos mudaram ao longo dessas quatro décadas, e alguns mudaram mais de uma vez, os pesquisadores relataram em 2013 na revista eLife.

A equipe de Bloom construiu a nucleoproteína de 1968, em seguida, testou os efeitos da introdução de cada mutação histórica. Algumas das mutações afetaram partes da proteína que derrubaram células do sistema imunológico de uma pessoa quando um invasor está presente – eles provavelmente ajudaram a detecção de vírus e evitaram a gripe. Mas por conta própria, algumas dessas mudanças foram ruins para o vírus: a nucleoproteína do vírus já não podia manter-se adequadamente dobrada o tempo suficiente para fazer o seu trabalho.

Durante o curso da evolução da nucleoproteína, algumas mutações impulsionaram a estabilidade da proteína, dando uma amortecida. Quando mutações posteriores ocorreram, permitindo que o vírus revertesse o reconhecimento imunológico, estas alterações anteriores provavelmente criaram a estrutura estável, de modo a proteína ainda pode funcionar.

Quando os efeitos de uma mutação dependem de outras mutações, essa interação é chamada de epistasia. Estas interações dentro de moléculas individuais foram importantes na formação de trajetórias evolutivas, diz o biofísico Michael Harms da Universidade de Oregon, que está estudando como diversas funções evoluíram em um grupo de proteínas chamadas S100S. Ele chama de epistasia de “a característica comum em toda a evolução”. Interações co-dependentes não ocorrem apenas entre os pares de mutações. Elas podem ser significativamente mais complexas. Analisando dados de outros laboratórios, Harms encontrou interações epistáticas envolvendo até seis mutações diferentes. Tal interação significa que, em muitos casos, se os genes tinham se transformado em algo um pouco diferente, a evolução teria virado para um curso diferente.

Luz verde
Os cientistas chamam mutações que lançam as bases para mudanças futuras de mutações “permissivas”. Algumas funções de proteínas surgiram somente após mutações permissivas modificado uma molécula evoluindo de forma altamente improvável.

Thornton usou a reconstrução de proteína ancestral para estudar como hormônios esteróides – que controlam as respostas ao estresse, crescimento e desenvolvimento sexual em vertebrados – evoluiu parcerias com os seus receptores. Os receptores são proteínas que se ligam a parceiros específicos para ativar respostas na célula. Ao comparar receptores de esteróides em espécies diferentes, Thornton pode mapear as relações evolutivas entre as moléculas e inferir a probabilidade da sequência de aminoácidos do seu ancestral comum. Em seguida, ele apresenta uma molécula de DNA que codifica a proteína de longa data extinta em células cultivadas em laboratório. Essas células usam as instruções genéticas para fabricar um pequeno pedaço do passado profundo.

Muitos dos estudos de Thornton começaram com uma proteína receptora de 450 milhões de anos de idade, que ele e seus colegas reconstruído em 2006 (Veja PROTEÍNAS PRÉ-HISTÓRICAS: RESSUSCITANDO OS MORTOS). A proteína deu origem a moléculas receptoras modernas que são ativadas por diferentes hormônios. Um receptor, o receptor de glucocorticóides, cortisol responde ao hormônio do stress. O outro, o receptor de mineralocorticóides, controla os níveis de sal e outros eletrólitos, em resposta ao hormônio aldosterona. A equipe de Thornton descobriu que seu antepassado reconstruído pode ser ativado por ambos, cortisol e mineralocorticóides.

Um receptor que respondeu apenas para cortisol apareceu 40 milhões de anos após o receptor promíscuo, como mostrou Thornton. Sua equipe descobriu um conjunto de alterações de aminoácidos que converteu o receptor ancestral geral para o específico do cortisol. Mas as mutações que mudaram a preferência do antigo receptor não poderiam ter gerado um receptor funcional por si só, foi o que os experimentos mostraram.

“As mutações de mudança de função não são toleradas por conta própria”, diz Thornton. Elas desestabilizam partes do receptor. Como a evolução da nucleoproteína do vírus da gripe, a estrutura do receptor ancestral teve que ser reforçada antes que pudesse suportar as mutações que tornam o receptor funcional.

Sem título
Duas mudanças de aminoácidos calmamente prepararam o receptor antigo para a sua transformação, Thornton e seus colegas relataram em 2009 na revista Nature. Sem eles, o caminho para a mutação de mudança de função teria sido inacessível. “Se tivéssemos voltado para trás o relógio e definido a história rolando novamente, é muito improvável que essas mutações permissivas iriam ocorrer”, diz ele. “Nós teria terminado com um receptor de glucocorticóide muito diferente e um sistema endócrino muito diferente”.

Thornton e Harms, em seguida com um pesquisador de pós-doutorado no laboratório de Thornton na Universidade de Oregon em Eugene, explorou se a evolução poderia ter tomado uma rota alternativa para o mesmo fim. Harms criou e exibiu milhares de variantes da proteína ancestral, em busca de mutações alternativas que poderiam ter configurado-o para a mesma opção funcional. Ele não encontrou nenhum, e os pesquisadores relataram na revista Nature em 2014. A evolução, ao que parece, tinha agido em uma oportunidade rara. Análises biofísicas de proteínas receptoras variantes mostraram por que tão poucas mutações habilitaram ligações específicas de cortisol a evoluir. Embora determinadas partes necessitem de suporte adicional, o receptor também tem de ser capaz de fazer a transição entre duas formas: uma conformação inativa quando não está presente o cortisol, e uma conformação de ativação de genes quando o hormônio se liga. Algumas mutações estabilizam a forma ativa do receptor, bloqueando-o para uma configuração “sempre-ligado”. As mutações também tiveram de ser compatíveis com a proteína ancestral por conta própria, antes que as mutações de mudança de função fossem introduzidas.

“Uma mutação tem de cumprir todos estes requisitos, e que não é fácil de acontecer”, disse Thornton. “Isso parece ser a explicação para o porquê mutações permissivas [para este interruptor funcional] serem tão raras.”

Mas nem todas nova funções são o resultado de interações epistáticas complicadas. Em janeiro, na eLife, Thornton e Ken Prehoda da Universidade de Oregon descreveu uma proteína antiga que ganhou uma nova função por meio de uma única alteração de aminoácido.

A equipe estudou as origens de uma proteína animal que ajuda as células a se orientar no espaço antes de se dividir. Fazer isso é vital para posicionar novas células nos lugares certos dentro de um corpo crescente. Formas de vida unicelulares tiveram que obter este direito antes que organismos multicelulares pudessem evoluir.

A mudança de um aminoácido transformado uma proteína que as reacções catalisadas de fazer blocos de ADN em um que actua como uma estrutura de suporte durante a divisão celular (mitose mostrado). andrew s. bajer/cell image library

A mudança de um aminoácido transformou uma proteína que as reações eram catalisadas para fazer blocos de DNA em um que atua como uma estrutura de suporte durante a divisão celular (mitose mostrada). Andrew s. bajer/cell image library

Thornton, Prehoda e colegas focaram-se sobre um segmento da proteína chamada GKPID (por GK domínio de proteína-interação), que orienta as células, atuando como um andaime durante a divisão. O bilhões de anos de idade ancestral de GKPID fez nada do tipo. Foi um predecessor da enzima para a moderna guanilato-quinase, que catalisa uma reação química que as células usam para fazer alguns dos blocos de construção de DNA. Surpreendentemente, Thornton diz, uma mutação foi suficiente para transformar a proteína ancestral de uma enzima a um andaime de trabalho.

Esse resultado surpreendentemente é um exemplo de que o desenvolvimento de teorias gerais sobre os princípios físicos que moldam a evolução requerem uma compreensão das histórias evolutivas de um conjunto mais amplo de proteínas.
“Toda vez que as pessoas tomam [uma proteína] à parte, eles vêem um novo recurso”, diz Harms. Felizmente, diz ele, graças aos computadores mais rápidos, melhores softwares e um número crescente de genomas de referência, a pesquisa sobre a reconstrução de uma proteína ancestral está em ascensão.

Pegando as estradas

Enquanto eventos fortuitos podem mudar a paisagem de possibilidades da evolução, proteínas em evolução também têm alguma liberdade para explorar. Elas podem pegar mais de um caminho para algumas funções.

Douglas Theobald, bioquímico da Universidade Brandeis em Waltham, Mass., tem visto isso em suas próprias investigações de uma enzima que muitas células usam para produzir energia sem oxigênio. A enzima, desidrogenase lactato, evoluíram a partir de enzimas estruturalmente semelhantes não apenas uma vez, mas, pelo menos, quatro vezes em diferentes grupos de organismos. Ao reconstruir os eventos evolucionários que transformaram uma enzima semelhante, a malato desidrogenase, em lactato desidrogenase, Theobald e colegas descobriram que dois grupos de parasitas unicelulares chegaram a mesma enzima de maneiras diferentes. Os investigadores relataram os resultados em eLife em 2014 e na Protein Science em fevereiro.

O trabalho demonstra que diferentes origens genéticas podem orientar a evolução ao longo de diferentes caminhos em diferentes organismos, mas ainda levar a resultados semelhantes, diz Theobald. “Mesmo que haja um monte de epistasia, ainda há muitas maneiras diferentes para a mesma função”.

A bioquímica Susan Marqusee da Universidade da Califórnia, Berkeley, também descobriu que há mais de uma maneira para uma proteína fazer algo novo.

Marqusee colaborou com a equipe de Thornton para comparar como duas bactérias, Escherichia coli e a Thermus thermophilus amantes do calor, evoluíram enzimas que fazem o mesmo papel em diferentes temperaturas. T. thermophilus prospera em águas termais, a temperaturas que fariam com que a maioria das proteínas desmoronassem. Os bioquímicos estão ansiosos para pegar emprestado estratégias da natureza para projetar proteínas tolerantes ao calor, mas têm lutado para encontrar princípios gerais que são responsáveis por essa propriedade. Ao reconstruir o RNA ancestral comum da enzima conhecido como H1 de E. coli e T. thermophilus, a equipe de Marqusee descobriu como a proteína bacteriana lida o calor.

Com 3 bilhões de anos de idade a enzima do ancestral comum era menos estável do que a que o T. thermophilus usa hoje, a equipe relatou em 2014 na revista PLoS Biology. Como a proteína tolerante ao calor evoluiu, sua estabilidade aumentou constantemente – não por causa de qualquer uma inovação, mas em virtude de estratégias biofísicas distintas em diferentes pontos no tempo.

“A físico-química realmente não importa, desde que, no final, eles somem o fenótipo certo”, diz Marqusee. Porque a evolução foi capaz de tirar partido de diferentes aminoácidos para aumentar a estabilidade de uma variedade de maneiras, que cresce a resiliência da enzima a ambientes quentes não depender da ocorrência fortuita de um determinado conjunto de mutações.

Futuro nebuloso

Estudos de como proteínas evoluíram no passado não são susceptíveis em expor a forma como a evolução prosseguirá no futuro. “O quadro que emerge é que o papel aleatório das mutações é tão grande que as previsões de longo prazo da evolução futura de qualquer proteína é muito arriscado”, diz Thornton. Mas pesquisas recentes oferecem insights sobre como e por que as proteínas de hoje fazem o que fazem.

Um antigo receptor de esteróides reconstruído se liga a um site de DNA associado com a sinalização do estrogénio (à esquerda), mas não para outros dois (média e direita) reconhecidos por receptores de esteróides que evoluíram mais tarde. O receptor não pode ligar-se aos outros devido a incompatibilidades físicas com partes do DNA.

Um antigo receptor de esteróides reconstruído se liga a um sítio do DNA associado com a sinalização do estrogênio (à esquerda), mas não para outros dois (meio e direita) reconhecidos por receptores de esteróides que evoluíram mais tarde. O receptor não pode ligar-se aos outros devido a incompatibilidades físicas com partes do DNA.

Um exemplo vem do trabalho de Thornton sobre a forma como os locais de ligação de DNA sobre os receptores de esteróides têm evoluído juntamente com os seus alvos de DNA. Os receptores ativados por hormônios atuam como fatores de transcrição, a ligação de seções específicas de DNA para ativar certos genes. Em 2014, a equipe de Thornton relatou na revista Cell que um aminoácido em uma proteína ancestral impediu-a de fazer a ligação ao trecho de DNA favorecido por muitos dos receptores de esteróides atuais. A proteína ancestral desajeitadamente colidido contra a DNA, incapaz de fazer contato suficiente para realmente agarrar. O receptor ganhou sua nova especificidade quando as mutações terminaram esses obstáculos e introduziram novos confrontos que bloquearam seu acesso ao antigo local de ligação.

Pesquisadores muitas vezes não podem dizer quais as diferenças entre duas proteínas relacionadas fazem-nas se comportar de forma diferente. Mas reconstruir caminhos evolutivos pode apontá-los na direção certa.

Usando a reconstrução ancestral, Theobald, Brandeis e a colega Dorothee Kern estudaram como a Abl, uma proteína que promove o crescimento ligado a leucemia mielóide crônica, divergiu da proteína relacionado Src. Os pesquisadores queriam saber por que a droga anticâncer Gleevec ligava-se e desligava Abl sem obstruir Src, embora Src tem uma estrutura muito similar. Theobald, Kern e seus colegas identificaram 15 aminoácidos em Abl que são cruciais para a ligação Gleevec. Os aminoácidos influenciam a forma das transições de proteína entre duas configurações diferentes (mudança de forma que é interrompida em alguns pacientes com cânceres resistentes a Gleevec). A descoberta, publicada no ano passado na revista Science, sugere que os pesquisadores podem ser capazes de desenvolver melhores drogas ao considerar estas mudanças conformacionais.

Algumas proteínas, ou partes de proteínas, podem até ser inerentemente mais capazes de evoluir que outras. Certas partes da proteína hemaglutinina viral passa por rápida evolução e são extraordinariamente tolerantes a mudança, Bloom e Bargavi Thyagarajan, que era um pesquisador de pós-doutorado no laboratório de Bloom, relatou isto em 2014 no eLife. Os anticorpos contra a hemaglutinina são a melhor defesa do sistema imunológico contra a gripe, mas a proteína é perita em escapar da detecção.

Os pesquisadores usaram um método relativamente novo chamado digitalização mutacional profunda para construir proteínas hemaglutinina teste com quase todas as possíveis mudanças de aminoácidos – cerca de 10.000 no total – em vírus cultivados em laboratório. Num hospedeiro, alterações que disfarçam hemaglutinina do sistema imunológico irão ser vantajosas. Mesmo que não haja um sistema imunológico para se esconder no laboratório, os vírus ainda sobreviveram a mais alterações de partes da hemaglutinina que seriam reconhecidas por um sistema imunitário do que eles fizessem mudanças em outras partes da proteína. Bloom e seu estudante de graduação Michael Doud relataram uma visão mais detalhada da proteína e as áreas que são mais ou menos propensas a tolerar mutações no bioRxiv.org em abril.

A cabeça da proteína, uma pesquisa recente encontra, é mais provável para assumir mutações (significa mais provável vermelho). Em contraste, a haste de a proteína é menos passível de mutações (amarelo significa menor probabilidade de mutação) e, portanto, pode ser uma melhor alvo para o desenvolvimento de vacinas.

A cabeça da proteína, uma pesquisa recente descobriu que é mais provável assumir mutações (vermelho significa o mais provável). Em contraste, a haste da proteína é menos passível de mutações (amarelo indica a menor probabilidade de mutação) e, portanto, pode ser uma melhor alvo para o desenvolvimento de vacinas.

Isso é bom para o vírus, mas ruim para as pessoas. Hemaglutinina parece capaz de acumular mudanças nos próprios sítios que desenvolvedores de vacinas gostariam de permanecer o mesmo. Mas a descoberta também sugere que as vacinas da gripe concebidas para atingir regiões de mutação tolerantes a hemaglutinina podem ser mais propensas a se proteger contra a gripe de estação para estação. Essa é uma estratégia de alguns laboratórios que já estão explorando – alvejando locais menos passivos de evoluir da estrutura em forma de pirulito de hemaglutinina.

Ainda não está claro por que certas partes da proteína hemaglutinina toleram mudar tão bem; Bloom espera que estudar a tolerância mutacional de outras proteínas possa ajudar os pesquisadores a descobrir isso.

“Nós nunca vamos ser capazes de prever a evolução precisamente, porque é um processo altamente estocástico”, diz Bloom. “Mas eu penso que nós podemos fazer melhores previsões sobre muitos dos processos evolutivos que nos afetam. Estes são problemas muito difíceis, mas acho que estamos chegando ao ponto em que podemos usar experiências e compreensão molecular para nos ajudar a pensar sobre esses processos. “

Fonte: Science News

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