A EDIÇÃO DE GENES COMEÇA A SALVAR VIDAS À MEDIDA QUE OS ENSAIOS HUMANOS COMEÇAM. (Comentado)

Em 2015, uma menina chamada Layla foi tratada com células imunes com gene-editados que eliminou todos os sinais da leucemia que a estava matando. O tratamento de Layla foi um único, mas até o final de 2017, a técnica poderia ter salvado dezenas de vidas.

Edição de salvar vidas. Sharon Lees / GOSH

Edição de salvar vidas. Sharon Lees / GOSH

A edição genética envolve a alteração ou desativação de genes existentes, que costumavam ser extremamente difíceis. Levou muitos anos para desenvolver a ferramenta de edição de genes que salvou Layla (foto), mas graças a um método revolucionário conhecido como CRISPR, isso agora pode ser feito em apenas algumas semanas.

De fato, o CRISPR funciona tão bem que o primeiro experimento humano envolvendo o método já começou. Na China, ele está sendo usado para desativar um gene chamado PD-1 em células imunes tomadas de indivíduos com câncer. As células editadas são então injetadas de volta para o corpo de cada pessoa. O PD-1 codifica um “interruptor desligado” na superfície das células imunitárias, e muitos cânceres evoluem a capacidade de frustrar os ataques imunológicos, movendo o interruptor PD-1 para “desligado”. Nas células imunitárias editadas não há interruptor para as células cancerosas virar.

Uma tentativa nos EUA, que deve começar em breve, é muito mais ambiciosa. Isso envolve a adição de um gene extra-projetado para tornar as células imunes alvo-tumores e, em seguida, usando CRISPR desativar PD-1 e dois outros genes. A adição de genes de orientação tumoral já produziu resultados muito promissores em ensaios para cânceres como a leucemia, mas não funcionou bem para tumores sólidos. A esperança é que a combinação das duas técnicas irá tornar os tratamentos muito mais eficazes.

Se estes ensaios mostram que a edição de genomas das células é segura, ele poderia em breve ser usado para tratar uma gama muito maior de doenças, provavelmente começando com distúrbios oculares.

Fonte: New Scientist

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Comentários internos

A notícia acima traz algumas das conquistas obtidas pelo novo método de edição de genes, o CRISPR, que tem grande potencial biotecnológico. Os avanços do CRISPR incluem a edição rápida de genes de forma barata e com maior precisão de atuação, e tal abordagem vem fazendo os cientistas e bioéticistas repensarem conceitos como organismo geneticamente modificado. O CRISPR esta se tornando público pelas conquistas que tem alcançado e vai chegar a discussões públicas. Para isto, é importante saber um pouco mais sobre o assunto.

CRISPR é uma sigla para Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, ou seja, Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaçadas. A direcionalidade precisa é alcançada por meio de um pequeno fragmento de RNA-guia projetado para espelhar uma sequência de DNA desejada (uma sequência-alvo) onde se liga usando uma atração única e específica a um dos quatro pares de bases do DNA.  Se você fizer um pedaço de RNA-guia de 20 letras de comprimento ele encontrará a sua sequência espelhada de DNA com a precisão de um GPS em meio a uma série de 30 milhões de letras que compõem o genoma do organismo a ser editado. Em seguida o corte é realizado por uma enzima chamada Cas9, isolada originalmente de culturas de bactérias em iogurte e que é levada ao local exato pelo RNA- guia. Por esta razão o sistema é chamado de CRISPR/Cas9.

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Um exemplo de como o método CRISPR funciona. Clique para ampliar. Fonte: Scientific American, 2016.

Uma vez que os editores gênicos cortam o DNA eles deixam a natureza fazer o trabalho sujo da mutação. Toda vez que a dupla hélice de DNA é cortada, a célula percebe a lesão e se põe a reparar a falha ou a ruptura com reparos, no entanto, estes não são perfeitos. Isto é exatamente o que torna o CRISPR tão poderoso. Mutações durante o processo de reparação em algumas letras do DNA normalmente são apagadas com o mecanismo produtor de proteínas de uma célula que lê o DNA em palavras de 3 letras (códon). Apagar ou eliminar algumas delas subverte todo o texto e essencialmente desativa o gene.

Assim, em cerca de três dias uma ferramenta de mutação personalizada para editar praticamente qualquer gene em praticamente qualquer organismo pode ser criada, ela é rápida barata e fácil de se fazer.

O passo mais complicado é construir o RNA-guia e sua estrutura que custa apenas algumas centenas de dólares. Diversas pequenas empresas de biotecnologia podem produzir este RNA sobre encomenda. Se a mão de obra foi levada em consideração o custo total chega a US$ 10.000 o que é extremamente barato no mundo da biotecnologia agrícola. Especialmente os botânicos ficaram empolgados com o CRISPR/Cas9, assim que a técnica foi publicada. A comunidade agrícola em 2014 mostrou que o método podia ser utilizado para tornar o trigo comum (Triticum aestivum) resistente a uma praga antiga e persistente, o oídio, que é uma doença causada em folhas por fungos.

Todas as culturas com genes editados exigem a mesma atenção regulatória que organismos geneticamente modificados. A técnica do CRISPR permite desativar qualquer gene, ou, com um pouco mais de esforço, acrescentar uma característica desejada ao inserir um gene em um local específico do genoma. Permite que cientistas evitem ou contornem as controvérsas técnicas de inserir o DNA de outras espécies em plantas: essas culturas transgênicas como o milho e a soja desenvolvida pela Monsanto que são resistentes e aos herbicidas da Roundup despertaram críticas de grupos anti-OGMs.

Culturas CRISPR são tão fundamentalmente diferentes que elas mudaram a essência do debate sobre alimentos geneticamente modificados. Entretanto, CRISPR só está sendo aplicado recentemente em culturas de commodities, por isto a questão ainda não chegou ao debate público.

Daniel Voytas, um acadêmico especialista em organismos geneticamente modificados tentou editar genes em plantas pela primeira vez a 15 anos quando estava na Universidade Estadual de Iowa, com uma tecnologia conhecida como dedos de zinco. Sua primeira empresa de edição gênica faliu devido a problemas com patentes. Voytas e seus colegas fundaram a empresa Calyxt e usaram o método TALEN (outro método de edição de genes) para produzir plantas geneticamente editadas que foram cultivadas em lavouras na América do Norte e do Sul. A Calyxt, por exemplo, criou duas linhagens de soja modificadas para produzir um óleo mais saudável com níveis de gorduras monoinsaturadas comparáveis aos óleos de oliva e canola. Eles editaram geneticamente uma linhagem de batatas para evitar o acúmulo de certos açúcares durante o armazenamento no frio reduzindo o sabor amargo. Diminuiram também a quantidade de acrilamida, um suspeito carcinogênico produzido quando as batatas são fritas.

Essas modificações genéticas, bem como as de CRISPR não envolveram a introdução de quaisquer genes estranhos (exógenos) e o Serviço de Inspeção de Saúde Animal e Vegetal do Departamento de Saúde dos Estados Unidos decidiu em 2015 que as culturas não precisam ser regulamentadas como organismos geneticamente modificados. Eles consideram as plantas apenas como padrão, como se tivessem sido geradas por agentes químicos mutagênicos, raios-gama ou alguma tecnologia não-regulamentada; o que é uma grande vantagem técnica.

Apesar de tudo, continua obscura a situação da patente do CRISPR; tanto da Universidade da Califórnia como do Instituto Broad do MIT, pois ambos alegam terem inventado o método e isto pode retardar o desenvolvimento comercial agrícola. A DuPont recentemente formou uma aliança estratégica com a Carimbou Biosciences, uma empresa de biotecnologia associada a Universidade da Califórnia em Berkeley (Hall, 2016).

Vaca Holstein-Frisia

Vaca Holstein-Frisia

Muitas aplicações ao CRISPR foram dadas nos últimos 3 anos. A Recombinetics, uma pequena empresa de biotecnologia com sede em Minessota bloqueou geneticamente o sinal biológico que regula o crescimento de chifres em vacas holandesas (Holstein-Frisia), carro-chefe da indústria de laticínios. Eles fizeram isso usando a edição gênica para replicar a mutação que ocorre naturalmente no gado de corte da raça Angus que não desenvolvem chifres. Os pesquisadores de ciências agrícolas defendem que essa aplicação na edição gênica é uma forma mais humanizada de criação porque poupa os animais de um procedimento cruel durante o qual os criadores de gado leiteiro têm que retirar fisicamente e depois cauterizar os chifres dos animais. O processo não envolve transgenia e apenas a alteração de algumas letras no DNA (Hall, 2016).

Em cogumelos aprimorados pelo método CRISPR, exigiu-se uma interferência mínima do DNA em comparação com os genes em OGMs, e embora se trate de modificação genética, não se encaixam na perspetiva “negativa” dos OGM porque não envolve transgenia ou cisgenia, ou seja, a inserção de genes entre espécies distintas ou proximamente-aparentadas.

Yinong Yang, pesquisador de fitopatologia da Universidade Estadual da Pensilvânia experimentou informalmente algumas enzimas primitivas de edição gênica pela primeira vez em meados da década de 90, mas seu laboratório publicou seu primeiro artigo usando o CRISPR somente em 2013.

Seu uso para editar cogumelos tem como objetivo impedir seu escurecimento. Os biólogos moleculares identificaram uma família de seis genes que são responsáveis por codificar uma enzima que causa o escurecimento-enzimático. Estes genes também causam escurecimento e maçãs e batatas e já se tornaram alvo de editores gênicos anteriormente. Quatro dos genes do escurecimento produzem as enzimas no esporocarpo (corpo frutífero ou carpóforo) do cogumelo. A ideia era desligar os genes através de uma mutação usando o método de edição que poderia reduzir a taxa de escurecimento. Fugicultores produzem cerca de 500 toneladas por dia de cogumelo e anualmente o mercado corresponde a US$ 1.2 bilhão de dólares para a economia. Editar o genoma do Champignon de Paris Agaricus bisporus corresponde a alterar a produção de 408.2 toneladas de cogumelo por ano (Hall, 2016). Do ponto de vista agrícola e econômico seria vantajoso pois evitaria a perda de alimentos por validade vencida; o produto demoraria mais para apodrecer e suportaria ficar mais tempo em prateleiras até seu estoque ser vendido, além de suportar o translado de grandes quantidades entre países sem perder uma fração pela validade.

Agaricus bisporus

Agaricus bisporus

Usando CRISPR cientistas coreanos e chineses produziram um porco com muito mais massa muscular ao aplicar a edição gênica e desativar o gene da miostatina (Hall, 2016). As aplicações do método são várias e já tem despertado temas polêmicos na bioética desde 2015.

Pesquisadores injetaram células-tronco humanas em embriões de suínos para produzir embriões híbridos. A ideia dos cientistas é remover o gene de um embrião recém-fertilizado de porco e inserir a versão humana que levaria ao desenvolvimento de órgãos (como o pâncreas) de nossa espécie dentro do suíno. O resultado é um “nicho genético” na estrutura genética do embrião animal.

Células-tronco totipotentes são capazes de se diferenciar em qualquer tecido do corpo e a ideia era utilizar parte deste potencial genético em embriões de porcos para usa-los como “incubadoras” de órgãos humanos. Os pesquisadores esperam que as células-tronco humanas ocupem o nicho genético no embrião de porco e gerem um pâncreas com tecido humano no feto. A edição genética seria então utilizada para a revitalização de pesquisa dos chamados xenoenxertos e o conceito de usar animais para produzir órgãos humanos.

O experimento, de fato, foi realizado com fetos que se desenvolveram em fêmeas de porcos durante 28 dias – o período completo de gestação d animal é de aproximadamente 114 dias. Após isso, a gravidez era interrompida e o tecido é removido para análise. Embora o embrião de porco se desenvolvia normalmente, o pâncreas produzido por ele era constituído quase exclusivamente por células humanas e será compatível com o de pacientes esperando transplantes. A repercussão ética foi grande, pois os porcos passaram a conter células humanas em diversas partes do corpo do feto, embora essas células tivessem “dificuldade de competir” com as células suínas. A discussão ficou em torno da possibilidade de que células humanas se desenvolveram em partes do corpo e até que ponto isto limitaria a diferença entre as duas espécies. Para piorar a divulgação científica de má-qualidade e o interesse midiático acabou distorcendo o real significado da pesquisa a situação de que “porcos se tornariam humanos”.

O National Institutes of Health, suspendeu o financiamento de experimentos semelhantes até que surjam mais informações sobre suas potenciais implicações após tais polêmicas. A principal preocupação é que as células humanas migrem para o cérebro dos porcos ao longo do processo, embora nenhuma pesquisa permita o desenvolvimento do feto do porco até o fim.

O potencial desta técnica é gerar órgãos humanos que poderiam ser usados não apenas para gerar pâncreas, mas corações, fígados, rins, pulmões e córneas reduzindo assim a fila de espera em transplantes. Outra vantagem deste processo é que o órgão seria uma cópia genética exata do fígado humano, só que muito mais jovem e saudável e não seriam necessárias tantas drogas imunossupressoras pois o índice de rejeição seria consideravelmente menor.

Os pesquisadores também estão tentando criar neurônios humanos a partir de embriões de porco para tratar pacientes com doença de Parkinson. Neste caso, embriões se desenvolvem durante 62 dias, e claro, a equipe de cientistas fica monitorando os efeitos da pesquisa no cérebro dos porcos. A ideia é que se observe a produção de tais órgãos, especialmente no cérebro, para que apesar das células ele não seja humano, e não permitir os fetos nasçam para evitar hibridismo e anormalidades (BBC, 2016).

O uso do CRISPR poderia ser estendido para reparar embriões ou editar genes de modo permanente, ou seja, na linha germinal de nossa espécie (óvulos e espermatozóides). Este potencial acaba trazendo discussões ambíguas e também voltadas a bioética: sobre o aprimoramento da espécie humana (Hall, 2016).

Alguns bioeticistas afirmam que a edição gênica em embriões tem um potencial promissor porque poderia erradicar doenças genéticas devastadoras antes de um bebê nascer. Outros dizem que esse trabalho atravessa uma linha ética perigosa, pois mudanças da linha germinal, são hereditárias, e poderiam ter um efeito imprevisível sobre as gerações futuras, além claro, da questão da eugenia.

Junjiu Huang, pesquisador em genética da Sun Yat-sen University em Guangzhou, tentou contornar essas preocupações usando embriões “não-viáveis” de humanos, ou seja, que não podem resultar em humanos vivos. Eles foram obtidos em clínicas locais de fertilidade. A equipe tentou modificar o gene responsável pela β-talassemia, um distúrbio potencialmente fatal do sangue, usando o sistema CRISPR/Cas9.

Huang e seus colegas procuraram ver se o procedimento poderia substituir um gene em um embrião humano de uma única célula fertilizada. A princípio, todas as células produzidas à medida que o embrião desenvolvia teria o gene reparado. Os embriões que eles obtiveram a partir das clínicas de fertilidade tinham sido criados para uso de fecundação em in vitro, mas tinha um conjunto extra de cromossomos, após a fertilização por dois espermatozóides. Isso impede que os embriões resultem em um nascimento vivo.

Grupo de Huang estudou a capacidade do sistema CRISPR/Cas9 em editar o chamado gene HBB, que codifica a proteína de β- globina em humanos. Mutações no gene são responsáveis pela β-talassemia.

Dos 71 embriões que sobreviveram, 54 foram geneticamente testados. Isto revelou que apenas 28 deles tiveram êxito, e que apenas uma fração deles continha o material genético de substituição. A implicação disto é que se a intensão é desenvolver embriões normais, é preciso estar mais perto dos 100% de êxito. Esse efeito é uma das principais preocupações de segurança que envolve a edição do gene da linha germinal porque essas mutações não-intencionais podem ser prejudiciais e definitivas. As taxas de tais mutações foram muito mais elevadas do que as observadas em estudos de edição genética de embriões de roedores ou células adultas humanas (Cyranoski & Reardon 2015).

Além da talassemia, outro potencial uso do sistema CRISP/Cas9 esta na anemia falciforme que é responsável por diversas conseqüências clínicas. Pesquisadores da Universidade da California e da Universidade de Utah and School of Medicine, pela primeira vez, corrigiram a mutação que dá origem à anemia falciforme, usando a técnica. A anemia falciforme apresenta-se genéticamente na forma homozigótica da Hemoglobina S (ou, HbSS). Ela é causada por uma mutação no sexto códon do gene da β- globina, localizada no cromossomo 11 onde ocorre a substituição da adenina por uma timina, gerando o aminoácido valina em vez de ácido glutâmico. A anemia falciforme é uma doença hereditária que no Brasil – e devido à miscigenação – afeta cerca de 0,1% a 0,3% da população afro-descendente. Cerca de 250 mil crianças em todo o mundo nascem com anemia falciforme todos os anos. A anemia falciforme leva a alterações da hemoglobina e consequentemente afeta a distribuição de oxigênio no corpo, além de poder causar entopimento de artérias.

O estudo foi feito em células-tronco hematopoiéticas, precursoras dos eritrócitos, que foram isoladas de pacientes e editadas.

Pesquisadores já relataram sucesso em corrigir a mutação em camundongos, embora as aplicações clinicas estão longe de acontecer. A eficiência do processo também é ligeiramente baixa para uso prático, como advertiu o autor Jacob Corn, um bioquímico da Universidade da Califórnia em Berkeley.

Empresas e acadêmicos tem investido em pequisa para fazer progressos, mas até mesmo CRISPR-Cas9, com sua facilidade e utilidade ainda não está à altura da tarefa. Corn e seus colegas encontraram uma maneira de tornar a modificação mais eficiente. Eles usaram uma pequena cadeia de DNA carregando a seqüência corrigida do gene da célula falciforme e projetaram-na para se ligar à cadeia de DNA deixada pendente após os cortes da enzima Cas9. Quando usado em células retiradas de pacientes com células falciformes humanas, a técnica aumentou a eficiência com a qual eles poderiam reparar os genes defeituosos em até 25%.

A equipe então introduziu essas células editadas em camundongos (e não ratos) de laboratório. Lá, a eficiência de sua técnica despencou: de fato, células com uma deleção no DNA pareciam proliferar melhor em ratos do que células com a forma corrigida do gene. Em camundongos, apenas 5% das células transplantadas produziram a forma normal da hemoglobina.

Alguns médicos que viram seus dados disseram que estariam dispostos a tentar a abordagem em ensaios clínicos. Mas o próprio Corn argumenta que prefere melhorar a eficiência antes de ser testado em pessoas.

Outro problema é que as tentativas de edição deixam muitos genes com uma deleção onde a enzima Cas9 cortou. Algumas dessas deleções podem resultar em produção anormal de hemoglobina – causando (paradoxalmente) a β-talassemia, citada acima.

Pesquisadores da Sangamo Biosciences enfrentaram este problema, e decidiram tentar uma abordagem diferente. A empresa e vários outros na área estão usando a edição de genes para interromper a expressão de um gene que suprime a produção de hemoglobina fetal: uma forma de hemaglobina que é expressa no feto em desenvolvimento e resiste à forma falciforme. O aumento da produção de hemoglobina fetal poderia assim reduzir a quantidade de hemoglobina em forma de foice em adultos.

Os resultados seguintes com CRISPR apoiam a ideia de que a segmentação da hemoglobina fetal pode ainda ser uma aproximação mais segura, mas ainda há um longo caminho a percorrer no sentido de encontrar formas de corrigir de forma segura o gene (Ledford, 2016).

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O uso do CRISPR em humanos e a bioética.

As baixas eficiências e o elevado número de mutações fora do alvo podem ser um empecilho para a aplicação da técnica, embora o pesquisador Huang argumente que no caso da anemia falciforme, os efeitos negativos poderiam ser específicos dos embriões anormais utilizados no estudo.

Glóbulos vermelhos (vermelho escuro) anormalmente formados são uma das características da anemia falciforme. Eye of Science/Science Photo Library.

Glóbulos vermelhos (vermelho escuro) anormalmente formados são uma das características da anemia falciforme. Eye of Science/Science Photo Library.

Ele reconhece a crítica a sua técnica, mas justifica dizendo que não há exemplos de edição de genes em embriões normais e diz que não há maneira de saber se a técnica opera de forma diferente neles. Em sua defesa, ele considera que os embriões permitem um modelo mais significativo – e mais próximo de um embrião humano normal – do que um modelo animal ou um usando células humanas adultas, em vez de apenas falar sobre o que aconteceria sem dados.

Edward Lanphier, defende que é preciso fazer uma pausa nesta pesquisa para nos certificarmos que temos uma discussão ampla sobre qual direção a pesquisa vai tomar.

Huang planeja descobrir como diminuir o número de mutações fora do alvo usando células humanas adultas ou modelos animais. Ele está considerando estratégias diferentes – ajustar as enzimas para orientá-las mais precisamente para o local desejado, introduzindo as enzimas em um formato diferente que poderia ajudar a regular sua vida útil e, portanto, permitir que genes sejam desligados antes que as mutações se acumulem, ou variando as concentrações de enzimas introduzidas e as moléculas de reparação. Talvez pelo uso do sistema TALEN, que é conhecido por causar menos mutações não-intencionais seja mais favorável (Cyranoski & Reardon 2015).

Há grandes preocupações quanto às implicações éticas e de segurança para estas técnicas de manipulação genética. A edição de genomas em embriões humanos usando tecnologias atuais pode ter efeitos imprevisíveis sobre as gerações futuras. Isso torna perigoso e eticamente inaceitável se for feito de forma irresponsável e sem as devidas reflexões sobre o potencial da técnica, as finalidades pelas quais será usada e os desdobramentos a longo-prazo.

Tal pesquisa poderia ser explorada para modificações não-terapêuticas. Uma violação ética pode dificultar uma área promissora de desenvolvimento terapêutico – mudanças genéticas que não possam ser herdadas.

A segurança do paciente é fundamental e esta entre os argumentos contra a modificação da linha germinativa humana. Se um embrião mosaico é criado, a linha germinal do embrião pode ou não carregar a alteração genética. Só será filosófica ou eticamente justificável as aplicações clínicas e terapêuticas desta tecnologia a partir do momento em que se torna possível demonstrar resultados seguros e obter dados reprodutíveis ao longo de várias gerações.

Devido essas preocupações éticas alguns países foram desencorajados ou proibidos de desenvolver pesquisa deste tipo por até uma década antes da viabilidade técnica de modificação da linha germinal ser confirmada em ratos em 2009.

Há dez anos, o Centro de Políticas Públicas e Genética, em Washington DC, reuniu mais de 80 especialistas dos Estados Unidos e do Canadá para considerar as conseqüências científicas e éticas de modificar geneticamente a linha germinal humana. Agora que a capacidade de engenharia da linha germinal humana surgiu a comunidade científica internacional quer participar desse tipo de diálogo. Isso é necessário tanto para estabelecer como proceder no prazo imediato quanto para avaliar se, e em que circunstâncias – se houver alguma – futuras pesquisas envolvendo modificação genética de células germinativas humanas devem ocorrer. Essas discussões devem incluir o público, bem como especialistas e acadêmicos. Um grande debate biotecnológico virá em breve (Lanphier etal, 2015).

Victor Rossetti

Palavras chave: NetNature, Rossetti, CRISPR, Edição gênica, Biotecnologia, Cogumelos, Embriões, Porco, Anemia falciforme.

 

Referências

Hall. S, S. Editando o Cogumelo. Scientific American. Abril – 2016
Voytas DF1, Gao C2. Precision genome engineering and agriculture: opportunities and regulatory challenges. PLoS Biol. 2014 Jun 10;12(6):e1001877
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