EVOLUÇÃO DE BACTÉRIAS RESISTENTES A ANTIBIÓTICOS – DUPLICAÇÃO, AMPLIFICAÇÃO E INOVAÇÃO GÊNICA.

As bactérias têm incomodado a vida daqueles que negam a teoria da evolução porque tem demonstrado processos de inovação e amplificação de informação referente a resistência a antibióticos e a origem de novas funções adaptativas.

Resistência a antibióticos

O primeiro e maior incômodo que as bactérias deram ao movimento anticiência denominado design inteligente foi o caso do flagelo bacteriano que claramente mostrou-se redutivelmente complexo. O caso chamou a atenção pelo revisionismo de biológico e a sugestão de se ensinar o conceito de design inteligente como contraposição ao ensino da evolução – sugerindo a ideia de que o flagelo bacteriano era tão complexo que não poderia ter surgido através do processo evolutivo. A isto, nomearam de complexidade irredutível!

Diante deste cenário o caso foi parar na suprema corte americana e se tornou o julgamento de Dover em 2005, com vitória para a evolução. A seleção natural tem claramente modificado sistemas flagelares e reduzido os não-funcionais quando eles não são mais necessários. Vestígios remanescentes de flagelos não-funcionais e de genes flagelares foram descobertos em várias espécies de bactérias (Halling, 1998). Este fenômeno é evidente, mesmo no organismo mais promíscuo usado por microbiologistas, a Escherichia coli K-12 que possui um resíduo de dois genes de um sistema sujeito a ablação flagelar (denominado Flag-2) (Ren et al, 2005).

Flagelos compartilham um conjunto básico e conservado de proteínas. Das cerca de quarenta proteínas do flagelo padrão de S. typhimurium LT2 ou mesmo da E. coli K-12, apenas algumas parecem ser universalmente necessárias. Todas as flagelinas mostram sequências semelhantes, indicando ancestralidade comum, ou seja, de homologia (Beatson et al, 2006).

Ao examinar as homologias entre os flagelos e proteínas não-flagelares ficou claro que várias subunidades flagelares compartilham um ancestral comum com componentes de outros sistemas biológicos e que a concepção de um modelo evolutivo para a origem do flagelo ancestral não requer nenhum grande salto conceitual.

Pode-se prever que o flagelo é resultado de decorrentes fusões entre vários subsistemas modulares. Um sistema de secreção construído a partir de proteínas de uma antiga ATPase, um filamento criado a partir de variantes de duas proteínas, um motor criado a partir de um canal iônico e um aparelho quimiotáxico construído a partir de domínios pré-existentes.

Então, agora o movimento do design inteligente recorre a ideia da impossibilidade de ocorrência de inovações evolutivas ou de informação. Nosso objetivo aqui é revelar quão errôneas são tais afirmações partindo de texto publicado por uma entidade representante deste movimento anticiência no Brasil. Infelizmente, aqui não disponibilizaremos o link de acesso ao texto, pois nosso compromisso é divulgar ciência e não o oposto. Contudo, selecionamos um fragmento deste texto que representa um ponto de partida para uma reflexão mais profunda, embora outros fragmentos deste texto e nossas respectivas considerações críticas já foram publicados anteriormente.

O fragmento retirado da produção informal do design inteligente que refere-se a impossibilidade de ocorrência de inovações evolutivas ou de informação está destacado abaixo:

Nenhuma verdadeira novidade foi gerada, mas apenas rearranjos limitados das informações inicialmente fornecidas. Temos visto um resultado semelhante em experimentos com bactérias pelo biólogo Richard Lenski, do estado de Michigan. Ele rastreou o desenvolvimento de 58.000 gerações de E. coli. Ele não viu nenhuma inovação verdadeira, mas principalmente a quebra de genes não essenciais para economizar energia, e o rearranjo da informação genética para acessar capacidades pré-existentes, como o metabolismo do citrato, sob diferentes estresses ambientais. As mudanças sempre foram estreitas no escopo e limitadas em magnitude.”

O citrato no meio age como um agente quelante e as bactérias E. coli não podem crescer nele. Contudo, pesquisas científicas sobre o processo evolutivo levaram as bactérias a se relacionar de forma positiva com o citrato.

Lenski e colegas publicaram um artigo intitulado “Historical contingency and the evolution of a key innovation in an experimental population of Escherichia coli” em 2008 na qual destacam que inicialmente nenhuma população havia desenvolvido a capacidade de explorar o citrato por >30.000 gerações, embora cada população tenha experimentado bilhões de mutações. No entanto, um uso positivo do citrato (Cit+) surgiu como variante em uma população nas gerações 31.500, causando um aumento no tamanho e diversidade desses microrganismos experimentados. A evolução tardia e única desta função e indica o envolvimento de alguma mutação extremamente rara. Eles testaram e repetiram experimentos e não haviam observado a emergência de mutantes de Cit+ em 8,4 x 10¹² moléculas ancestrais, nem entre 9 x 10¹² células a partir de 60 clones amostradas nas primeiras 15.000 gerações. No entanto, observaram uma tendência significativamente maior para os clones posteriores evoluírem Cit+, indicando que alguma mutação potencial surgiu nas gerações 20.000. Eles concluíram que a contingência histórica é especialmente importante quando facilita a evolução de inovações-chave que não são facilmente evoluídas pela seleção gradual e cumulativa.

De fato, a taxa de mutação da linhagem ancestral da Cit – para Cit+ é imensamente baixa; mesmo o limite superior é de 3,6 × 10¯¹³ por geração de células, o que é três ordens de magnitude abaixo da taxa de mutação típica do par de bases. No entanto, uma população acabou desenvolvendo a função Cit+.

O estudo de Lenski e colegas demonstrou que a evolução dessa nova função dependia da história da população em que ela surgiu. Eles mostraram que uma ou mais mutações anteriores potencializaram a evolução dessa função, aumentando a taxa de mutação para Cit+, embora mesmo a taxa elevada seja muito menor do que uma taxa de mutação típica.

A potencialização parece atuar de modo específico a função de Cit+, que poderia ser explicada pelo mecanismo da epistasia, em que a expressão funcional da mutação finalmente rendeu o Cit+, ou seja, o fenótipo requer interação com uma ou mais mutações que evoluíram anteriormente. Outra possibilidade é que a produção física da mutação que gerou o fenótipo Cit+ necessitou de alguma mutação previamente ocorrida que permita a geração da sequência final. Por exemplo, a inserção de um elemento genético móvel dispara a criação de novas sequências em suas junções, e uma dessas pode então sofrer mutações que levam a uma sequência final nova que não poderia ter ocorrido sem a inserção. O genoma de E. coli possui muitos elementos de sequência de inserção (Schneider et al, 2002), alguns dos quais têm sido ativos durante esta experiência evolutiva de longo-prazo (Schneider & Lenski, 2004). Qualquer que seja o mecanismo, essa potenciação tornou o Cit+ mutacionalmente acessível e funcional.

Esta nova capacidade foi refinada ao longo das próximas 2.000 gerações, levando a uma expansão massiva da população à medida que as células evoluíam e passavam a explorar mais eficientemente o abundante citrato em seu ambiente. Embora as células Cit+ continuassem a usar glicose, eles não conduziam a subpopulação Cit- extinta porque tais células eram concorrentes superiores para glicose. Assim, a diversidade geral aumentou à medida que uma população deu origem evolutivamente a uma comunidade ecológica com duas variedades, uma especializada em um tipo de recursos e outra generalista.

A origem desta nova função representa uma inovação chave que envolveu várias etapas confeccionadas através de gerações e nos fornece uma demonstração explícita da importância da contingência histórica na evolução. Ela ultrapassa os limites fenotípicos de uma espécie diversa e bem estudada e leva a uma transição ecológica de uma única população para uma comunidade de duas variedades. Como ressaltou Lenski, este processo claramente suscita uma base genética para uma inovação na medida em que o surgimento do fenótipo Cit+ indica pelo menos dois eventos genéticos importantes: a origem da função em sua forma fraca; e seu posterior aprimoramento – especialização – para o uso eficiente do citrato. Pelo menos uma mutação nesta experiência evolutiva de longa duração foi necessária para produzir um fundo genético com potencial para gerar variantes de Cit+ e a distribuição e dinâmica de mutantes Cit+ em testes de flutuação indicam que pelo menos duas mutações adicionais estão envolvidas.

Duas questões emergem deste experimento: 1) Qual será o destino a longo-prazo do Cit+ coexistindo com subpopulações de Cit-? Lenski e colegas mostraram que os dois tipos coexistem de forma estável devido à inferioridade das células Cit+ na competição por glicose. No entanto, a linhagem Cit+ pode eventualmente adquirir mutações que compensam seu desempenho inferior em glicose, prejudicando assim a coexistência; 2) Será que as linhagens Cit+ e Cit- eventualmente poderiam tornar-se espécies distintas?

O conceito de espécie biológica amplamente utilizado por parte dos biólogos geralmente utiliza os animais e plantas como referencial porque prezam pela continuidade através da reprodução sexuada, levando ao isolamento genético entre as espécies (Mayr, 1942). Embora as bactérias sejam estritamente assexuadas, seria possível testar a hipótese produzindo genótipos recombinantes. Contudo, tais experimentos exigiriam controles para examinar os efeitos de adequação das mesmas mutações na linhagem em que surgiram. Se a linhagem Cit+ está realmente evoluindo para uma nova espécie, seria de se esperar então que, com o tempo, mais e mais mutações benéficas substituídas naquela linhagem fossem prejudiciais no contexto ecológico e genético de seu progenitor Cit-.

Em todo caso, o estudo mostra que a contingência histórica pode representar um impacto profundo e continuo sob as condições mais simples e, portanto, mais rigorosas, nas quais populações inicialmente idênticas evoluem em ambientes idênticos. Mesmo a partir de um começo tão simples, pequenas ocorrências da história podem levar as populações ao longo de diferentes caminhos evolutivos.

Algumas análises anteriores deste experimento mostraram numerosos exemplos de evolução fenotípica e genética paralela. Todas as 12 populações passaram por uma melhora rápida na aptidão que desacelerou ao longo do tempo (Lenski et al, 1991; Cooper & Lenski, 2000; Lenski, 2004; Lenski, 1994) e evoluíram taxas de crescimento máximas mais altas na glicose, fases de lag mais curtas após a transferência para meio fresco, densidades de população de pico reduzidas e tamanhos médios de células maiores em relação ao seu ancestral (Lenski, 2004). Dez populações evoluíram desenvolvendo um super-enrolamento de DNA (Crozat et al, 2005).

Além disto, as populações analisadas mostraram mudanças paralelas nos perfis gerais de expressão gênica (Cooper et al, 2008; Cooper, Rozen & Lenski, 2003; Pelosi et al, 2006): Ao menos três genes têm substituições em todas as 12 populações (Woods et al, 2006; Cooper et al, 2001), e vários outros contêm substituições em muitas populações (Crozat et al, 2005; Woods et al, 2006), ainda que a maioria dos loci não tenha substituições em nenhuma delas (Lenski et al, 2003). Concomitantemente, também houve divergência entre as populações. Quatro delas evoluíram apresentando ineficiência em mecanismos de reparo do DNA, causando fenótipos mutados (Cooper & Lenski, 2000). Há uma leve mas perceptiva variação entre a população na aptidão média no meio limitado pela glicose em que eles evoluíram (Lenski et al, 1991). Em meios contendo outras fontes de carbono, como maltose ou lactose, a variação no desempenho é muito maior (Travisano et al, 1995). E enquanto os mesmos genes muitas vezes abrigam substituições, a localização precisa e os detalhes das mutações quase sempre diferem entre as populações (Crozat et al, 2005; Pelosi et al, 2006).

As bactérias ainda apresentam sistemas de compensação por efeitos colaterais mal adaptativos que incluem resistência a fagos (vírus de bactérias) e a antibióticos – que tem sido observada em muitos outros experimentos.

Todas as 12 linhas melhoraram em aproximadamente a mesma quantidade, mostrando que a evolução é reproduzível. Contudo, algumas linhagens melhoraram mais rapidamente do que outras, e as analisas genéticas das linhagens mostraram que elas tomaram caminhos evolutivos diferentes. Por exemplo, seis destas linhagens desenvolveram defeitos nos mecanismos de reparo do DNA e, em vez de desaparecer, começaram a sustentar taxas de mutação cada vez mais altas do que suas contrapartes.

Outras diferenças marcantes surgiram na geração 6500, cerca de 3 anos depois do início do experimento, duas variedades de E. coli claramente surgiram: uma que formava pequenas colônias consistindo de células relativamente pequenas e uma que formava grandes colônias, com células grandes. Lenski esperava que, eventualmente, um tipo assumisse o controle e o outro desaparecesse, ou ambos seriam expulsos por uma bactéria com uma mutação ainda mais benéfica. Mas, os dois tipos persistiram, criando um ecossistema no qual a competição e outras interações entre os tipos de colônia permitiam que ambas fossem viáveis. O que aconteceu é que Lenski criou suas próprias “ilhas Galápagos” (Science, 2003).

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Resistência a antibióticos

Trabalhos como de Richard Lenski e outros são importantes para entendermos a evolução das bactérias. Um dos casos mais importantes está a resistência a antibióticos. Os antibióticos revolucionaram a medicina em muitos aspectos. Sua descoberta foi um ponto de virada na história humana na medida que aumentou a expectativa de vida. Contudo, lamentavelmente, o uso de medicamentos foi acompanhado pelo rápido aparecimento de cepas altamente resistentes. Especialistas estão agora alertando para um retorno à Era Pré-Antibiótica; um banco de dados recente lista a existência de mais de 20 mil genes potenciais de resistência (chamados de genes r) de quase 400 tipos diferentes (Livermore et al, 2007) – ainda que o número existente como determinantes da resistência funcional em patógenos é muito menor.

Uma ampla gama de mecanismos bioquímicos e fisiológicos pode ser responsável pela resistência das bactérias a antibióticos. A complexidade dos processos que contribuem para o surgimento e amplificação populacional da resistência não pode ser subestimada, e a falta de conhecimento básico sobre esses tópicos é uma das principais razões pelas quais houve tão pouca realização significativa na prevenção e controle eficazes do desenvolvimento de resistência. A maioria das agências internacionais, nacionais e locais reconhece esse problema com seriedade e muitas resoluções e recomendações foram propostas. Numerosos artigos foram escritos, mas em vão: o desenvolvimento da resistência aos antibióticos é evidente no cenário atual mundial.

Muitas revisões acadêmico-referenciais excelentes descrevendo a genética e bioquímica das origens, evolução e mecanismos de resistência aos antibióticos surgiram nos últimos 60 anos. Descobriu-se desde então, genes nos genomas bacterianos que podem gerar um fenótipo de resistência proto-resistente ou de quase-resistência. Gêneros, espécies, linhagens e variedades diferentes exibem faixas de fenótipos de resposta a antibióticos. Desde o início deste milênio, a disponibilidade de técnicas genômicas de mutagênese e o sequenciamento rápido do genoma bacteriano permitiu conhecer muitas funções genéticas potenciais de bactérias que podem levar a fenótipos de resistência em situações clínicas. Por exemplo, a rota genética mais comum para aumentar a resistência a antibióticos é a amplificação gênica.

As atividades humanas têm papel fundamental na criação de reservatórios ambientais que geram resistência a antibióticos. Desde a década de 1940, quantidades cada vez maiores de antibióticos designados para aplicações humanas têm sido fabricadas, usadas clinicamente e claro, liberadas no meio ambiente e amplamente disseminadas, proporcionando assim constante seleção inconsciente indireta e fazendo a manutenção de cepas resistentes em todos os ambientes. É difícil obter dados precisos sobre as quantidades de antimicrobianos produzidos pela indústria farmacêutica (já que não é do interesse das empresas farmacêuticas fornecer tais informações), mas pode-se estimar que muitos milhões de toneladas de compostos antibióticos foram liberados a biosfera ao longo do último meio século (Gottlieb, 1976). Tal produção comercial fornece o vasto volume dos antibióticos encontrados na biosfera na qual as bactérias têm contato e se tornam resistentes.

Considerando o descarte em larga escala de resíduos tóxicos, metais, desinfetantes, biocidas e resíduos de processos de fabricação, as quantidades de xenobióticos nocivos liberados na biosfera são inestimáveis. O fato de muitas das substâncias químicas descartadas serem recalcitrantes (resistentes) à biodegradação apenas agrava a questão. O despejo de ciprofloxacina em rios em níveis superiores a 50 kg por dia por fabricantes de produtos farmacêuticos em Hyderabad, na Índia central (Fick et al, 2009), é um dos episódios mais extremos da história da resistência e do descarte irresponsável. Níveis semelhantes de poluição semelhante podem provavelmente estar ocorrendo em outras partes do mundo sem nosso conhecimento. Além de fornecer uma seleção poderosa para a formação de cepas super-resistentes em todos os gêneros bacterianos, danos fisiológicos a populações residentes locais de insetos, pássaros, animais e humanos não podem ser dimensionados (Carlsson et al, 2009). Diversas atividades antropogênicas – incluindo o uso de antibióticos na agricultura e aquicultura –, aplicações não-humanas de antibióticos e descarte de resíduos criam importantes reservas ambientais de resistência (Doyle, 2006) e, muito provavelmente, de genes de alta virulência e organismos que podem abrigá-los (Moura et al, 2010).

Durante a aquisição da resistência incorre em um sério custo energético para o microrganismo e, de fato, muitos mutantes resistentes podem ser limitados ao crescer sob condições laboratoriais. Como resultado, considerou-se que as cepas multirresistentes seriam instáveis ​​e de curta duração na ausência de seleção (Andersson, 2006). No entanto, as condições laboratoriais (especialmente os meios de cultura) não duplicam as circunstâncias da vida real e as evidências sugerem que patógenos com múltiplas mutações e combinações de genes de resistência evoluem e sobrevivem com sucesso in vivo. Dois estudos sobre o desenvolvimento de S. aureus mutantes e multirresistentes e M. tuberculosis fornecem exemplos que anulam os pressupostos anteriores.

No primeiro estudo, os microrganismos isolados de um paciente hospitalizado tratado com o antibiótico vancomicina foram amostrados em intervalos freqüentes após a admissão hospitalar e analisados ​​pelo sequenciamento do genoma. Nos passos para o desenvolvimento do isolado final (mortal), 35 mutações puderam ser identificadas ao longo de 3 meses (Mwangi et al, 2007). Da mesma forma, foi relatado que o sequenciamento do genoma de cepas resistentes a antibióticos do M. tuberculosis revelou 29 mutações independentes em uma cepa MDR e 35 mutações em uma cepa XDR (Davies & Davies, 2010).

Qualquer um dos elementos genéticos acessórios encontrados nas bactérias pode adquirir genes e promover sua transmissão; sendo que o tipo de elemento envolvido varia com o gênero do patógeno. Existem tanto semelhanças quanto diferenças claras entre as bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, mas a transmissão mediada por plasmídeo (moléculas circulares que se duplicam independentemente) é de longe o mecanismo mais comum para favorecer a transferência horizontal de genes.

Parece que tais eventos são bastante comuns em S. aureus (Skurray & 1997) e em estreptococos, meningococos e gêneros relacionados, a troca de genes de virulência e patogenicidade é altamente promíscua. O principal mecanismo para o intercâmbio de DNA parece ser a transformação (Springman et al, 2009). No que diz respeito à aquisição direta de DNA no ambiente, Acinetobacter spp. são naturalmente competentes em adquirir via transferência horizontal de genes (Barbe et al, 2004) e cepas patogênicas tipicamente carregam grandes ilhas genômicas (Perez et al, 2007).

A transmissão gênica por conjugação tem sido estudada extensivamente em laboratório e em microcosmos que se aproximam das condições ambientais, e as frequências dos eventos de transferência variam significativamente. Experiências sugerem que as frequências de transmissão conjugativa na natureza são provavelmente várias ordens de grandeza superiores às condições de laboratório (Sorensen et al, 2007; Linton, 1977).

Há ainda os Integrons, que são elementos incomuns (sítios de ligação e promotores) que atuam como mecanismos de aquisição, acumulação e expressão de novos genes que foram primeiramente identificados e caracterizados por Stokes e Hall em 1987 (Stokes et al, 1989); Análises retrospectivas indicaram que elas estavam associadas aos genes de resistência presentes nos isolados de Shigella que caracterizaram a primeira onda de resistência mediada por plasmídeos transferíveis no Japão na década de 1950 (Linton, 1977).

Portanto não basta só receber nova informação ou alternar copias de informação antiga para obter novas. A primeira medida de resistência ainda é o processo de amplificação gênica. A amplificação gênica é encontrada em todos os três reinos da vida e é importante tanto para a evolução de novas espécies (Bergthorsson et al, 2007), mas também para a genética médica como um importante contribuinte para muitas doenças humanas, variabilidade fenotípica entre os indivíduos e susceptibilidade humana a doenças infectocontagiosas (Beckmann et al, 2007). Além disso, a amplificação gênica desempenha um papel importante na geração da variabilidade genômica disponível para adaptação genética a condições de crescimento ou de várias tensões.

As bactérias podem adaptar-se à presença de níveis tóxicos de antibióticos com vários tipos de resposta, incluindo não apenas os mecanismos regulatórios que alteram a fisiologia celular ou alterações genéticas (como mutação ou transferência horizontal de genes), mas também a partir da degradação ou sequestro do antibiótico, evitando sua absorção, bombeando-o para fora da célula ou impedindo sua ligação à molécula alvo (Harbottle et al, 2006).

No caso da amplificação gênica, ela confere resistência ao causar a superprodução de enzimas modificadoras de antibióticos, moléculas alvo e bombas de efluxo. A adaptação bacteriana aos antibióticos geralmente ocorre em duas etapas: 1) o mecanismo de resistência inicial é adquirido, o que na maioria dos casos confere uma redução na aptidão bacteriana. Posteriormente, as bactérias se adaptam à presença do dispendioso mecanismo de resistência, adquirindo mutações compensatórias adicionais que reduzem a custo, muitas vezes sem perda da resistência.

É importante ressaltar que, embora o mecanismo de duplicação/amplificação gênica envolva uma alteração, tem propriedades que são diferentes de uma adaptação genética típica por mutação ou da transferência horizontal de genes. Apesar da duplicação/amplificação gênica ser altamente prevalente, duplicações gênicas são muito mais instáveis do que mutações ou transferência horizontal de genes, tornando-se um mecanismo mais semelhante a uma resposta reguladora.

Em função das freqüências e tamanhos das regiões amplificadas estima-se que 10% de todas as células bacterianas em uma cultura contém uma duplicação de genes em algum lugar em seu genoma (Roth et al, 1996). A freqüência de qualquer duplicação específica é determinada pelas taxas de formação e perda da duplicação e por quaisquer alterações na aptidão associadas à dosagem genética alterada. Se considerarmos que em uma placa de Petri podemos ter até 400.000.000 de bactérias, 10% delas correspondem a 40.000.000 e devem conter duplicações de genes.

Para medir a taxa de duplicação de uma região específica ou do gene todo é preciso começar com uma população de células que não contém duplicações pré-existentes daquela região (tipicamente uma população de 1.000 células) e, ao longo do tempo, observar o aparecimento de duplicações. Alguns cálculos prévios feitos indicam que a taxa de formação de duplicações espontâneas em Salmonella typhimurium varia entre 10¯² a 10¯5 por célula por geração, dependendo da duplicação (Pettersson et al, 2008).

Os custos de adequação (ou seja, as taxas de crescimento reduzidas) que são associados a duplicações foram rigorosamente medidas em apenas alguns casos. Em cepas de S. Typhimurium contendo duplicações geneticamente modificadas (variando em tamanho de 72 kb a 1.246 kb) apresentaram custos variáveis ​​com fenótipos que variaram de modo a ser indistinguíveis ao tipo selvagem e mostraram uma redução na taxa de crescimento 20% por geração (Pettersson et al, 2008), sem qualquer correlação entre o tamanho da região duplicada e o custo de adequação. Isto indica que o custo é determinado principalmente pelo conteúdo genético da região duplicada, em vez do custo metabólico de se adquirir DNA extra.

A partir disso, a hipótese do equilíbrio da dosagem genética sugere que desequilíbrios estequiométricos em complexos macromoleculares levam a redução da aptidão quando a dosagem do gene é alterada como resultado da duplicação/amplificação gênica (Veitia, 2004). Por exemplo, a superprodução de uma sub-unidade específica que faz parte de um complexo macromolecular possa titular outras sub-unidades no mesmo complexo. Outra razão potencial para esses custos pode ser que as proteínas produzidas em excesso tenham efeitos negativos nas vias de dobramento de proteínas e na função de acompanhante que exercem.

Algumas duplicações surgem por recombinação homóloga não-igual entre sequências repetitivas longas e diretamente orientadas, como operons de RNA ribossomal (Anderson & Roth, 1981) sequências de inserção ou elementos transponíveis (Bertini et al, 2007) e sequências repetitivas palindrômicas extragênicas (Haack & Roth, 1995) que estão presentes em cromátides irmãs por um mecanismo dependente de processos denominados recA: na qual sequências curtas de repetição ou junções aleatórias de extremidades na ausência de qualquer sequência repetitiva geram algumas duplicações genéticas espontâneas.

Mecanismos propostos de duplicação e amplificação gênica – a) A duplicação ocorre através de recombinação homóloga não-igual entre repetições orientadas diretamente ou através de mecanismos independentes de RecA entre regiões de curta ou nenhuma homologia. b) Duplicação e amplificação gênica através da replicação de círculos rolantes. Uma quebra de fita dupla permite a invasão de fita simples em um site homólogo ou micro-homológico seguido de replicação. Setas horizontais denotam regiões de homologia (longas ou curtas) envolvidas na recombinação (linhas tracejadas) entre as cromátides irmãs que formam a duplicação inicial. Os retângulos horizontais indicam o tamanho da região de homologia.

Uma vez que uma duplicação é formada, a amplificação de nível mais alto pode ocorrer por recombinação dependente deste processo (Reams & Neidle, 2004). Portanto, tais evidências indicam que, sob certas condições seletivas, a quantidade de DNA na célula pode ser quase totalmente duplicada devido à amplificação de alto nível de regiões específicas (Andersson et al, 1998).

Duplicações e amplificações muitas vezes podem ser estabilizadas por mutações (Anderson & Roth, 1978) e também por seleção. Portanto, mesmo que seqüências repetidas sejam recorrentemente perdidas por muitas células na população, a seleção irá enriquecer continuamente a população para células que mantêm a duplicação ou amplificação promotora do crescimento (Brochet et al, 2008).

Os primeiros exemplos de níveis aumentados de resistência a antibióticos resultantes do aumento do número de cópias de genes foram encontrados no início dos anos 70 com a descoberta de que diferentes plasmídeos aumentaram de tamanho quando eram cultivados na presença de antibióticos. O primeiro exemplo foi o plasmídeo Nr1 que aumentou em tamanho quando o Proteus mirabilis contendo plasmídeo foi cultivado na presença de uma baixa concentração dos antibióticos aos quais o plasmídeo forneceu a resistência a cloranfenicol, estreptomicina e sulfonamida, mas não a tetraciclina (Rownd & Mickel, 1971). Assumiu-se então que os genes que codificam a resistência a estes três antibióticos residiam juntos em uma dada região determinante, enquanto os genes que codificam a resistência à tetraciclina não. Isso acabou por ser verdade e confirmado posteriormente.

Freqüência e tempo de resposta para mutações pontuais, duplicação gênica e respostas regulatórias em uma população – Mudanças regulatórias na expressão gênica podem ocorrer rapidamente em grande parte da população em resposta a mudanças no ambiente de crescimento. As duplicações gênicas estão presentes em uma subpopulação de células, e a amplificação adicional de genes pode ser selecionada em resposta a mudanças no ambiente de crescimento. Mutações pontuais específicas são raras em uma população e, portanto, leva muito tempo até que mudanças na população como resultado dessas mutações sejam vistas.

Na maioria dos casos em que a resistência aos antibióticos é conferida pela amplificação do gene, o aumento da resistência está claramente relacionado ao aumento dos níveis do produto gênico do gene amplificado. Contudo, pela alta freqüência com a qual ocorrem amplificações em uma dada população a amplificação gênica também pode ser um primeiro passo para aumentar a resistência e, logo em seguida acumula mutações pontuais mais raras no gene amplificado. A probabilidade disso ocorrer é aumentada quando há o aumento do número de cópias do gene alvo (Bergthorsson et al, 2007) ou genes não-relacionados que aumentam ainda mais a resistência. A amplificação é inicialmente estabilizada pela expressão aumentada do gene de resistência, mas pode ser perdida após a ocorrência de uma mutação que produz resistência de alto nível.

Um estudo sobre o sistema de detecção de amplificação seguido por seleção mutacional foi realizado para compreender melhor como se dava o aumento da resistência a β-lactama (Sun et al, 2009) que é um composto constituinte de diversas famílias de antibióticos. O composto possui a capacidade de hidrolisar as penicilinas e as cefalosporinas (Matagne et al, 1990). A evolução da resistência a novos antibióticos β-lactâmicos ocorreu principalmente por meio da mutação que melhorou as atividades catalíticas das β-lactamases existentes (Petrosino et al, 1998). Como a resistência a antibióticos β-lactâmicos é linearmente correlacionada com o nível de β-lactamase (Nordstrom et al, 1972), os β-lactâmicos são um bom sistema experimental para estudos de amplificação. Ao desafiar a S. typhimurium que transporta o gene da resistência (blaTeM1) em um plasmídeo F′ com níveis progressivamente crescentes de cefalotina (uma cefalosporina de primeira geração) ou cefaclor (uma cefalosporina de segunda geração), mutantes com resistência aumentada às cefalosporinas foram rapidamente selecionados. A maioria dos clones (70%) com resistência aumentada aumentou os números de cópias do gene blaTeM1 em até 40 vezes. A continuação da passagem em série de linhagens com amplificações levou, em vários casos, a um número reduzido de cópias do gene mas manteve ou aumentou os níveis de resistência às cefalosporinas. Em várias dessas linhagens, a perda mutacional da expressão das porinas OmpC, OmpD e OmpF causaram o aumento da resistência pela redução do influxo de antibióticos na célula. Este experimento mostra como a amplificação pode não apenas gerar resistência aumentada como uma resposta primária aos antibióticos, mas também pode facilitar o desenvolvimento de resistência aumentada estável através de mutações pontuais sub-seqüentes, permitindo crescimento celular e expansão populacional.

Mutações de resistência frequentemente mostram um custo geral de condicionamento físico que se manifesta como uma taxa de crescimento reduzida e/ou virulência na ausência da droga. Durante o crescimento na ausência da droga, freqüentemente surgem mutações que compensam o custo de adaptação da mutação de resistência, levando a tensões com aptidão restaurada e a manutenção da resistência a drogas (Andersson, 2003). Em um estudo publicado, a compensação ocorreu através da amplificação de um gene do tipo selvagem que não estava relacionado com a mutação de resistência original. A amplificação compensatória foi observada nos mutantes que codificam a formil transferase (fmt) que são enzimas usadas em medicamentos que inibem o crescimento bacteriano impedindo a remoção do grupo formil da formilmetionina (fMet), que é incorporada como o primeiro aminoácido na maioria das proteínas. Como a remoção do grupo formil é essencial para a função de muitas proteínas, isto resulta na morte celular. As células tornam-se resistentes ao inibidor através de mutações fmt que eliminam a formilação de metionil-trNAfMet (Met-trNAfMet; trNA iniciador carregado), evitando assim a necessidade de remoção do grupo formil.

Amplificação de trNAfMet melhora o custo de mutações resistentes à actinonina: a) via de iniciação traducional em Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium. b) A inibição da atividade da deformilase peptídica pela actinonina leva ao acúmulo de proteínas não funcionais e morte celular. c) Mutações de resistência em fmt ou folD evitam a deficiência de deformilação, abolindo a formilação. d) A amplificação de metZ e metW, os genes que codificam a iniciação tRNAfMet, leva a uma concentração celular aumentada de Met-tRNAfMet e aumenta a iniciação sem formilação. fMet, formil-metionina; Fmt, formil transferase; SE, fator de iniciação; MAP, metionina aminopeptidase; PDF, deformilase peptídica.

Tal mutação de resistência gera um grande custo de adaptação devido ao comprometimento do início da síntese de proteínas. Este custo de adequação pode ser parcialmente compensado, sem perda de resistência a drogas, quando o trNAfMet é super-produzido e permite o início da síntese de proteínas que é obtida pela amplificação de dois genes.  Esta amplificação restaura a adequação quase normal às cepas com a mutação de resistência.

Em um trabalho publicado em 1998 Lenski cita uma série de outros casos de resistência a antibióticos. Björkman et al. (2007) estenderam essas descobertas demonstrando que mutantes de Salmonella typhimurium resistentes à estreptomicina, rifampicina ou ácido nalidíxico geralmente eram avirulentos em camundongos, indicando que este patógeno sofre um profundo custo de resistência a antibióticos. Mas como foi um caso in vitro, as bactérias desenvolveram mutações compensatórias que reduziram o custo da resistência e restauraram sua virulência, mesmo quando mantinham sua resistência aos antibióticos.

Há motivos de sobra para se presumir que fenômenos semelhantes ocorrem na natureza. Por exemplo, a Neisseria gonorrhoeae foi por muitos anos universalmente suscetível à ampicilina. Em 1976, as primeiras cepas resistentes foram detectadas e tinham uma β-lactamase codificada pelo plasmídeo, provavelmente derivada de uma bactéria entérica. Se algum outro antibiótico tivesse sido usado para tratar a gonorréia quando a resistência à ampicilina fosse detectada pela primeira vez, e enquanto o plasmídeo que transmitia a resistência ainda estivesse instável, a resistência poderia ter desaparecido da população e a ampicilina poderia então ter sido usada por muitos mais anos.

Mas uma vez que o plasmídeo foi estabilizado, tornou-se difícil ou impossível restaurar a sensibilidade. Reduções evolutivas no custo da resistência também explicam a surpreendente tenacidade da resistência à tetraciclina e estreptomicina (Sundin & Bender, 1996). O papel da redução de custos em estender a persistência dos genes de resistência a antibióticos na natureza merece um estudo mais cuidadoso porque tem implicações claras na saúde pública – demonstrando que a evolução biológica tem importância na saúde pública.

A evolução da resistência, os custos associados às funções de resistência e a subsequente redução de custos também ocorrem em outras circunstâncias. McKenzie et al. (1982) descrevem um exemplo de que todos esses fenômenos ocorrem também em insetos considerados praga. Por cerca de dez anos, o inseticida diazinona foi utilizado com sucesso para controlar a mosca-das-vacas australianas, Lucilia cuprina. Uma mutação que conferiu resistência finalmente apareceu e moscas resistentes ao diazinon e consequentemente se espalharam. No início, as moscas resistentes desenvolveram-se mais lentamente e reduziram a sobrevivência em relação aos seus progenitores sensíveis na ausência de inseticida, indicando um custo de resistência. Depois de alguns anos de uso continuado de diazinon, no entanto, uma segunda mutação apareceu na população de moscas que eliminou o custo da resistência. As moscas resistentes aos diazonóides que tinham esta segunda mutação eram tão adequadas quanto as moscas sensíveis na ausência de diazinona.

Em resumo, a redução de custos evolucionários é uma manifestação simples e geral da tendência dos organismos a serem submetidos à adaptação genética pela seleção natural. Assim como os organismos podem se adaptar para superar aspectos adversos de seu ambiente externo (por exemplo, tornando-se resistentes a antibióticos), eles também podem se adaptar para superar aspectos adversos de sua fisiologia interna (por exemplo, reduzindo quaisquer efeitos colaterais nocivos de resistência).

Portanto, algumas lições podem ser tiradas destes exemplos: a princípio, a sensibilidade aos antibióticos é um recurso renovável. Se houver um custo de resistência às bactérias, a sensibilidade pode ser renovada suspendendo-se temporariamente o uso de um antibiótico para o qual a resistência emergiu, permitindo assim que genótipos sensíveis desloquem competitivamente suas contrapartes resistentes; No entanto, após a evolução da resistência aos antibióticos, as bactérias podem então adaptar-se aos efeitos colaterais deletérios e outros custos dos genes de resistência. Portanto, com o uso continuado de um antibiótico após o surgimento de genótipos resistentes, pode tornar cada vez mais difícil renovar a sensibilidade.

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Conclusão

Com relação à evolução em geral e à evolução da resistência a antibióticos notamos que a alta prevalência e a instabilidade intrínseca da maioria das duplicações/amplificações gênica têm várias implicações importantes: 1) a alta frequência da duplicação/amplificação gênica no estado estacionário da maioria dos genes em dada população bacteriana indica claramente que a seleção para células com amplificação gênica em vez de mutação é a resposta inicial as condições seletivas que são resolvidas pelo aumento da atividade gênica (Roth et al, 2006). Por conseguinte, se o crescimento é limitado por um fator externo (um antibiótico) ou um fator interno (uma mutação de resistência deletéria) e o problema pode ser mitigado pelo aumento do nível de um produto gênico, as duplicações/amplificações gênicas comuns provavelmente serão mais selecionadas do que mutações pontuais raras. Muitas vezes o gene que confere a limitação que é amplificado, mas às vezes a dosagem aumentada de um gene não relacionado pode resolver o problema; 2) a duplicação/amplificação gênica poderia fornecer uma solução inicial para um problema seletivo e, assim, permitir que uma população se expandisse para um tamanho suficientemente grande para gerar uma solução mutacional estável subsequente. Assim sendo, a duplicação/amplificação gênica poderia servir como intermediário e facilitador no desenvolvimento de uma adaptação genética estável. Tais mudanças estáveis ​​poderiam ocorrer fora da região amplificada e ser permitidas somente pela expansão populacional, ou poderiam afetar os genes amplificados.

Finalmente, como a amplificação parental é frequentemente instável e pode ser dispensável depois de ocorrer uma adaptação estável, é concebível que as amplificações intermediárias não deixem vestígios de sequência no genoma. Desta forma, o papel intermediário da amplificação pode escapar da detecção quando estes intermediários estáveis ​​forem estabelecidos, porque a amplificação é rapidamente perdida após a seleção ser relaxada. Isso poderia ser relevante em contextos clínicos, e é possível que a contribuição da duplicação/amplificação gênica para resistência a antibióticos, falhas no tratamento com antibióticos e adaptação do hospedeiro seja perdida porque a duplicação/amplificação gênica já foi perdida quando os isolados clínicos são caracterizados geneticamente.

Assim, ao procurar pela duplicação/amplificação gênica em isolados clínicos, pode ser de grade valor examinar as cepas imediatamente após o isolamento dos pacientes sem qualquer crescimento não seletivo precedente no laboratório. Os métodos de sequenciamento do genoma inteiro que dependem de pequenas quantidades de DNA são de interesse e devem permitir a análise da duplicação/amplificação gênica “in situ” em uma população bacteriana recuperada diretamente de um paciente (Ishoey et al, 2008).

As bactérias beneficiam claramente da posse de um gene de resistência a antibióticos quando o antibiótico correspondente está presente. Inicialmente as bactérias resistentes sofrem um custo de resistência (isto é, uma redução na aptidão) quando o antibiótico está ausente. Nesse caso, uma estratégia para controlar a disseminação da resistência seria suspender o uso de um antibiótico em particular até que os genótipos resistentes diminuíssem para baixa frequência.

Uma questão importante, portanto, é se as bactérias podem superar o custo da resistência por meio de adaptações em evolução que neutralizam os efeitos colaterais prejudiciais dos genes de resistência. De fato, vários experimentos (in vitro e in vivo) mostram que o custo da resistência a antibióticos pode ser substancialmente diminuído, até mesmo eliminado, por mudanças evolutivas em bactérias em períodos de tempo bastante curtos. Como conseqüência, torna-se cada vez mais difícil eliminar os genótipos resistentes simplesmente suspendendo o uso de antibióticos.

O aparato bacteriano gênico é representado por dois tipos de estruturas: o nucleóide, que, do ponto de vista funcional estrutural, corresponde ao cromossomo, e uma segunda categoria de estruturas é representada pelos elementos gênicos extra-cromossômicos (plasmídeos, transposons, integrons, seqüências de inserção, etc.) (Mihăescu et al, 2007). De acordo com estes dois tipos de estruturas, os determinantes gênicos são divididos em duas categorias:

  • Genes essenciais (eucromossômicos), situados na estrutura do cromossomo e contendo a informação genética que assegura o desenvolvimento das funções essenciais para a existência da célula, ou seja, o conjunto dos determinantes minimamente necessários para codificar a arquitetura da célula e assegurar o metabolismo energético e de biossíntese, crescimento, divisão e regulação de diferentes atividades celulares, e:
  • Genes acessórios, com localização plasmídica ou na estrutura dos elementos genéticos transponíveis ou fagos portadores da informação genética que permite à célula adquirir uma melhor adaptação a condições ambientais novas ou modificadas.

Durante o estresse com antibióticos, as bactérias saprobiônticas e as patogênicas aumentam claramente sua taxa de mutação, o que significa que elas se tornam hipermutantes. Eles expressam e duplicam as informações de sobrevivência, também os genes resistentes a drogas, situados em plasmídeos, transposons e integrons (Mihăescu et al, 2007). Quando estão sob o estresse de antibióticos, algumas bactérias trocam os genes que desempenham um papel na síntese de alguns produtos proteicos, o que pode aumentar a taxa de mutação dentro das bactérias deixando-o até 10.000 vezes mais rápido que a taxa de mutação que normalmente aparece na divisão celular binária. Isso leva a um tipo de “hiper-evolução”, quando a mutação atua como um mecanismo de autodefesa para as bactérias, aumentando o risco de se obter um mutante resistente a antibióticos (Kaiser, 2006).

Vale ressaltar o fato de que as bactérias têm uma grande capacidade de preservar seu material genético conferindo-lhes uma vantagem seletiva-evolutiva e preserva as mutações vantajosas mesmo na presença da ação dos mecanismos reparadores do DNA, que tendem a corrigi-los (Mihăescu et al, 2007).

Recentemente, uma equipe de pesquisadores, liderada pelo Institut National de la Recherche Agronomique (INRA) na França, em colaboração com o professor Willem van Schaik, da Universidade de Birmingham, desenvolveu um novo método para identificar genes de resistência em bactérias intestinais, comparando os resultados tridimensionais de estruturas enzimáticas de resistência a antibióticos que são produzidas pelas bactérias intestinais.

Os pesquisadores, em colaboração com outras equipes europeias, aplicaram esse método a um catálogo de vários milhões de genes do intestino. Graças a esse método, eles identificaram mais de 6 mil genes de resistência a antibióticos que são muito diferentes dos genes previamente identificados em bactérias patogênicas.

Ao comparar as estruturas de proteínas de resistência a antibióticos conhecidos às proteínas produzidas pelas bactérias do intestino humano, encontraram milhares de novos genes de resistência a antibióticos no intestino humano, destacando a imensa diversidade de genes de resistência neste ambiente. A maioria desses genes parece estar presente em bactérias que vivem em um relacionamento inofensivo com o hospedeiro humano, portanto pode não ser uma ameaça imediata à saúde humana (Ruppé, 2018).

No entanto, o uso contínuo de antibióticos pode fazer com que esses genes de resistência sejam transferidos horizontalmente para bactérias patogênicas, reduzindo ainda mais a eficácia dos antibióticos no tratamento de infecções.

Victor Rossetti

Palavras chave: NetNature, Rossetti, Duplicação gênica, Amplificação gênica, Resistência a antibióticos, Evolução, Bactérias.

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